FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA Tesis Validación del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana vigente. Lima 2023 Para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico Presentado por: Autor: Reyes Villalobos, Daniel Rafael Código ORCID: https://orcid.org/0009-0009-7038-1471 Asesor: Dr. Collanque Pinto, Jesús Daniel Código ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2855-1632 Lima – Perú 2024 DECLARACIÓN JURADA DE AUTORIA Y DE ORIGINALIDAD DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN VERSIÓN: 01 CÓDIGO: UPNW-GRA-FOR-033 FECHA: 08/11/2022 REVISIÓN: 01 Yo, Daniel Rafael Reyes Villalobos egresado de la Facultad Farmacia y Bioquímica y Escuela Académica Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Universidad privada Norbert Wiener declaro que el trabajo de investigación “Validación del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana vigente. Lima 2023.” Asesorado por el docente: Collanque Pinto, Jesús Daniel DNI 09401989 ORCID 0000-0003-2855-1632 tiene un índice de similitud de 12 % con código oid:14912:342713617 verificable en el reporte de originalidad del software Turnitin. Así mismo: 1. Se ha mencionado todas las fuentes utilizadas, identificando correctamente las citas textuales o paráfrasis provenientes de otras fuentes. 2. No he utilizado ninguna otra fuente distinta de aquella señalada en el trabajo. 3. Se autoriza que el trabajo puede ser revisado en búsqueda de plagios. 4. El porcentaje señalado es el mismo que arrojó al momento de indexar, grabar o hacer el depósito en el turnitin de la universidad y, 5. Asumimos la responsabilidad que corresponda ante cualquier falsedad, ocultamiento u omisión en la información aportada, por lo cual nos sometemos a lo dispuesto en las normas del reglamento vigente de la universidad. ………………………………………………. Autor: Daniel Rafael Reyes Villalobos DNI: 43443829 ………………………………………………. Asesor: Collanque Pinto, Jesús Daniel DNI: 09401989 Lima, 09 de Octubre del 2024 DECLARACIÓN JURADA DE AUTORIA Y DE ORIGINALIDAD DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN VERSIÓN: 01 CÓDIGO: UPNW-GRA-FOR-033 FECHA: 08/11/2022 REVISIÓN: 01 Es obligatorio utilizar adecuadamente los filtros y exclusión del turnitin: excluir las citas, la bibliografía y las fuentes que tengan menos de 1% de palabras. EN caso se utilice cualquier otro ajuste o filtros, debe ser debidamente jutificado en el siguiente recuadro. NO SE UTILIZO AJUSTE O FILTROS____________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ iii Tesis “Validación del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana vigente. Lima 2023.” Línea de investigación Salud y Bienestar Asesor: Dr. COLLANQUE PINTO, JESÚS DANIEL Código ORCID: 0000-0003-2855-1632 iv DEDICATORIA A mi madre Elizabeth Elena por creer siempre en mí y ser mi apoyo cuando más lo necesito. Al equipo de trabajo de Microbiología y la Dra. Rosario Chocano. v AGRADECIMIENTO Agradecer a Dios por disfrutar del milagro de la vida, al Dr. Jesús Daniel Collanque Pinto por su valioso tiempo en guiarme en la elaboración de este trabajo de investigación, a su vez a los Dres. Federico Martin Malpartida Quispe y Pedro Iván Sáenz por la enseñanza de calidad. vi Índice general Pág. Portada i Titulo ii Dedicatoria iii Agradecimiento iv Índice general v Índice de tablas viii Índice de figuras x Resumen xi Abstract xii Introducción xiii CAPÍTULO I: EL PROBLEMA 1 1.1. Planteamiento del problema 1 1.2. Formulación del problema 3 1.2.1. Problema general 3 1.2.2. Problemas específicos 3 1.3. Objetivos de la investigación 4 1.3.1. Objetivo general 4 1.3.2. Objetivos específicos 4 1.4. Justificación de la investigación 5 1.4.1 Teórica 5 vii 1.4.2 Metodológica 5 1.4.3 Practica 5 1.5 Limitaciones de la investigación 6 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO 7 2.1. Antecedentes de la investigación 7 2.2. Bases teóricas 13 2.3. Formulación de Hipótesis 24 CAPÍTULO III: METODOLOGÍA 25 3.1. Método de investigación 25 3.2. Enfoque de la investigación 25 3.3. Tipo de investigación 25 3.4. Diseño de la investigación 26 3.5. Población, muestra y muestreo 26 3.6. Variables y operacionalización 27 3.7. Técnicas e instrumentos de recolección de datos 28 3.7.1 Técnica 28 3.7.2 Descripción de instrumentos 42 3.7.3 Validación 43 3.7.4 Confiabilidad 43 3.8. Plan de procesamiento y análisis de datos 43 3.9. Aspectos éticos 47 viii CAPÍTULO IV: PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 48 4.1. Resultados 48 4.1.1. Análisis descriptivo de los resultados 48 4.1.2. Prueba de hipótesis 69 4.1.3. Discusión de los resultados 69 CAPÍTULO V: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 72 5.1. Conclusiones 73 5.2. Recomendaciones 74 Referencias 74 Anexos 83 Anexo 1. Matriz de consistencia 83 Anexo 2. Instrumento de recolección de datos 84 Anexo 3. Certificado de validez de contenido del instrumento 89 Anexo 4. Confiabilidad del instrumento 98 Anexo 5. Aprobación del comité de ética 98 Anexo 6. Carta de aprobación de la institución para recolección de datos 99 Anexo 7. Testimonios Fotográficos 100 Anexo 8. Informe de asesor de Turnitin 102 Anexo 9. Materiales y equipos de ensayo 103 Anexo 10. Flujograma del Proceso de Validación 105 ix INDICE DE TABLAS Tabla 1: Preparación y uso Microorganismos de Prueba 18 Tabla 2: Agentes Neutralizantes comunes/ Métodos para Sustancias de Interferencia 21 Tabla 3: Propiedades Indicadoras de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de los medios de cultivo 32 Tabla 4: Criterios de Aceptación de Prueba de Promoción de Crecimiento y Propiedades Indicadoras e inhibitorias de los medios de cultivo 45 Tabla 5: Criterios de aceptación de la Prueba de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos 46 Tabla 6: Procesamiento de Parámetros Estadísticos 47 Tabla 7. Estandarización de cepas de prueba 48 Tabla 8. Suspensión de trabajo 49 Tabla 9. Recuperación de microrganismos en medios de cultivo 50 Tabla 10. Propiedades Indicadoras de Promoción de crecimiento e Inhibición de 51 los medios de cultivo Tabla 11. Recuperación de Microorganismos en presencia del producto /Ensayo 1 52 Tabla 12. Recuperación de Microorganismos en presencia del producto/ Ensayo 2 53 Tabla 13. Recuperación de Microorganismos en presencia del producto/ Ensayo 3 54 Tabla 14. Recuperación de microorganismos específicos 55 Tabla 15. Recuperación de microorganismos específicos en medios selectivos 55 /Pseudomonas aeruginosa x Tabla 16. Recuperación de microorganismos específicos en medios selectivos/ 56 Staphylococcus aureus Tabla 17. Comparación de la Eficacia neutralizante en el grupo de Prueba A (10-1) 57 en referencia al grupo Control (B) Tabla 18. Comparación de la Eficacia neutralizante en el grupo de Prueba A (10-2) 58 en referencia al grupo Control (B) Tabla 19. Comparación de la Toxicidad del Neutralizante en el Grupo Control (B) 59 en referencia al grupo Viabilidad (C) Tabla 20. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo de prueba (A) Dilución 60 10-1/ Grupo Control (B) Tabla 21. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo de prueba (A) Dilución 61 10-2/Grupo Control (B) Tabla 22. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo Control (B)/ Grupo 62 Viabilidad (C) Tabla 23. Resultados de Coeficiente de Variación en los Grupos de tratamiento 63 Tabla 24. Comparación entre el grupo de Prueba (A) Dilución 10-2/ Grupo Control 64 (B) Tabla 25. Límite de Detección de Pseudomonas aeruginosa 65 Tabla 26. Límite de Detección de Staphylococcus aureus 66 Tabla 27. Estadística de muestras emparejadas en grupo de tratamiento 67 xi INDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de estandarización de cepas de Prueba 30 Figura 2. Esquema de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos 38 Figura 3. Esquema del Límite de Detección 40 Figura 4. Esquema de Validación del Método de Neutralización 42 xii Resumen La presente investigación tuvo como Objetivo: Validar la Técnica analítica de Recuento Microbiano, mediante la dilución - neutralización del Amonio Cuaternario al 0,25 %, utilizando como Método de vertido en placa para la recuperación de microorganismos de prueba, para el desarrollo de los parámetros estadísticos se utilizó los Softwares SPSS y Minitab. Los Resultados obtuvieron recuentos menores a 100 UFC para las Cepas Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus Subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 10231 y Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, la prueba de Aptitud recuperó todos los microorganismos de prueba en la dilución 10-2 y presentó crecimiento e identificación de microorganismos específicos. La Validación del método de neutralización evidenció eficacia adecuada del neutralizante en la dilución 10-2 y a su vez se demuestra la ausencia de toxicidad del neutralizante. La Exactitud de los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del intervalo de confianza del 90%, la Precisión del ensayo se encuentra < 15 % del coeficiente de variación, a su vez se demuestra que los neutralizantes utilizados son específicos para inhibir las propiedades antimicrobianas del Amonio Cuaternario. El Límite de detección recuperó Pseudomonas aeruginosa > 11 UFC y Staphylococcus aureus > 17 UFC la robustez demuestra que no existe variabilidad significativa en los recuentos, en distintos tiempos de incubación Concluyendo que el método de dilución – Neutralización con Lecitina de soya 0,5% y Polisorbato 80 4%, permitió la recuperación de los microorganismos de prueba en la dilución 10-2. xiii Palabras clave. Validación, Dilución - Neutralización, Recuento Microbiano. Abstract The objective of this research was: To validate the analytical technique of Microbial Counting, through the dilution - neutralization off Quaternary Ammonium at 0.25%, using the method of pouring onto a plate for the recovery of test microorganisms, for the development of the parameters. SPSS and Minitab software were used for statistics. The Results obtained counts less than 100 CFU for the Strains Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus Subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 10231 and Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, the Aptitude test recovered all the test microorganisms in the 10-2 dilution and presented growth and identification of specific microorganisms. The Validation of the neutralization method showed adequate efficacy of the neutralizer at the 10-2 dilution and in turn demonstrated the absence of toxicity of the neutralizer. The accuracy of the recovery percentages is within the 90% confidence interval, the Precision of the test is < 15% of the coefficient of variation, in turn it is demonstrated that the neutralizers used are specific to inhibit the antimicrobial properties of Ammonium. Quaternary. The Detection Limit recovered Pseudomonas aeruginosa > 11 CFU and Staphylococcus aureus > 17 CFU. The Robustness demonstrates that there is no significant variability in the counts, at different incubation times. Concluding that the dilution method – Neutralization with 0.5% soy Lecithin and Polysorbate 80 4% allowed the recovery of the test microorganisms in the 10-2 dilution. xiv Keywords. Validation, Dilution - Neutralization, Microbial Count. INTRODUCCION La validación de métodos microbiológicos es de gran importancia, ya que asegura que la técnica analítica a implementar para el análisis microbiológico de dispositivos médicos a base de solución de Amonio Cuaternario al 0,25 % garantice que la calidad microbiológica que presente el producto se encuentre dentro de los límites establecidos por el laboratorio y a su vez cumpla con los lineamientos de las entidades regulatorias. En el capítulo I se plantean y formula el problema general y específicos, y se exponen el objetivo general y específicos, a su vez se plantea la justificación teórica, metodológica y práctica. En el capítulo II se presentan los antecedentes nacionales e internacionales de validación microbiológica, y el contenido de las teorías de la investigación. En el capítulo III muestra el tipo, el enfoque, y el diseño de esta investigación; se presenta la matriz con las variables y operacionalización, a su vez se plantea la técnica e instrumentos de recolección de datos, los aspectos éticos donde se protege la confidencialidad del producto y su formulación. En el capítulo IV, se exponen los resultados y la discusión a partir del desarrollo de los objetivos específicos. En el capítulo V se presentan las conclusiones y recomendaciones con respecto a esta investigación. CAPÍTULO I: EL PROBLEMA 1.1. Planteamiento del problema Desde la década de los años 50 del siglo pasado, se reportó la aparición de las primeras cepas bacterianas capaces de adquirir resistencia a biocidas, demostrando la capacidad de los microorganismos de realizar mutaciones para resistir a estos compuestos (1); ocasionando que reduzca su acción para el cual fue elaborado y por lo tanto estos microorganismos puedan generar infecciones (2). La presencia de Amonio Cuaternario para limpieza de superficies presenta actividad bactericida para la recuperación de microorganismos de prueba. La Farmacopea Americana (USP NF 2023) menciona los neutralizantes para inhibir esta acción, pero no la concentración a utilizar, el cual un neutralizante en estudio requiere ser validado, para demostrar la eficacia del método de recuperación de la carga microbiana que podría presentar el producto (3). El ensayo microbiológico de Dispositivos Médicos no se encuentra descritos en las Farmacopeas u otras referencias reconocidas, por lo cual se deben establecer parámetros de validación y los resultados deben evaluarse con métodos estadísticos apropiados, basados y descritos en las Farmacopeas (4). 2 En la “Ley de los Productos Farmacéuticos, Dispositivos Médicos y Productos Sanitarios” (Ley N° 29459) establece las pautas para la elaborarlos, en el cual la inspección de plantas de fabricación de laboratorios es asumida por la Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas (DIGEMID) para el cumplimiento de su certificación, mediante las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) (5), a su vez siguiendo los lineamientos de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) (6). Actualmente la validación de métodos microbiológicos para Dispositivos Médicos no se encuentra normados por DIGEMID y el Centro Nacional de Control de Calidad (CNCC); el cual cada laboratorio valida e implementa la metodología de los productos que requieran ser validados. La norma de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) menciona que los métodos analíticos deben ser validados para su uso previsto, verificando inicialmente si el producto terminado que se analiza por primera vez presenta interferencias a partir de los excipientes o el principio activo (7). El laboratorio elabora soluciones de Amonio Cuaternario al 0,25%, por la acción bactericida que presenta, es necesario que se implemente un esquema de neutralización para la recuperación de microorganismos de prueba, y se determine los parámetros de validación teniendo como referencia la Farmacopea Americana, en el cual presentan pautas para el desarrollo de los parámetros de validación mediante la interpretación de los datos, criterios de aceptación y el desarrollo de métodos estadísticos (8). Productos con potencial antibacteriano no son exentos de contaminación microbiológica, en ocasiones se han reportado casos de detección de microorganismos fuera 3 de sus especificaciones, lo cual la entidad reguladora DIGEMID tiene la facultad de alertar, retirar y posteriormente ordenar su destrucción (9). Es necesario determinar y validar un método de neutralización para la solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para lograr recuperar los microorganismos que podrían encontrarse en las muestras. La importancia de desarrollar este ensayo es garantizar la calidad de este Dispositivo Médico (10). 1.2. Formulación del problema 1.2.1. Problema General ¿Será posible validar el ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25 % para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana Vigente. Lima 2023? 1.2.2. Problemas Específicos a.- ¿Cómo se estandariza las cepas de referencia basado en la Farmacopea Americana? b.- ¿Cómo se verifica la prueba de Promoción de Crecimiento de los Medios de Cultivo basado en la Farmacopea Americana? c.- ¿Cómo se realiza el procedimiento de Aptitud del Método en presencia del producto basado en la Farmacopea Americana? d.- ¿Cuál será la Validación del método de neutralización más adecuado para neutralizar las propiedades antimicrobianas basado en la Farmacopea Americana? 4 e.- ¿Cuáles son los Parámetros de Validación del ensayo microbiológico basado en la Farmacopea Americana? 1.3. Objetivos de la investigación 1.3.1. Objetivo general Determinar la validez del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana Vigente. Lima 2023. 1.3.2. Objetivos específicos a.- Estandarizar las cepas de referencia basado en la Farmacopea Americana. b.- Realizar la prueba de Promoción de Crecimiento de los Medios de Cultivo basados en la Farmacopea Americana. c.- Determinar la Aptitud del Método en presencia del producto basado en la Farmacopea Americana. d.- Determinar la Validación del Método de Neutralización más adecuado para neutralizar las propiedades antimicrobianas basado en la Farmacopea Americana. e.- Determinar los Parámetros de Validación del ensayo microbiológico basado en la Farmacopea Americana. 5 1.4. Justificación de la investigación 1.4.1. Teórica Implementar una metodología para la validación teniendo como referencia la Farmacopea Americana, ya que actualmente no existe normativa para la validación del ensayo microbiológico de Dispositivos Médicos. La Validación del ensayo microbiológico sirve para demostrar que el método de análisis a emplear para el recuento Total de Microorganismos Aerobios Mesófilos (RTMA), Recuento total de Hongos y Levaduras (RTHL) y Microorganismos Específicos sean de confiabilidad, evitando obtener falsos resultados negativos o falsos resultados positivos. 1.4.2. Metodológica Esta investigación servirá de referencia para la elaboración de protocolos de Validación en futuras investigaciones que se realizarán a Dispositivos Médicos no invasivos, que presenten Amonio Cuaternario en su composición. 1.4.3. Práctica La presente investigación tiene como finalidad dar validez e implementar la técnica analítica del Recuento total de Microorganismos Aerobios Mesófilos, Recuento Total de Hongos y Levaduras y la recuperación de Microorganismos Específicos, para dar confiabilidad al ensayo microbiológico del Dispositivo Médico. 6 1.5. Limitaciones de la investigación Se realizó una búsqueda exhaustiva de información, encontrándose escasas investigaciones de validación relacionados a la Validación de Amonio Cuaternario. Para resolver esta investigación se utilizó como material de referencia validaciones de productos farmacéuticos y la Farmacopea Americana NF 2023. 7 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes de la investigación ANTECEDENTES INTERNACIONALES Araujo et al. (11). En el año 2011. En este articulo tuvo como objetivo realizar la validación de la neutralización del conservante y del método para el conteo microbiano. De acuerdo con la USP 30 y el informe técnico número 33 de la Asociación de Medicamentos Parenterales (PDA). Se utilizaron microorganismos ATCC Gram positivos y Gram negativos, Levaduras la mayoría y medios de cultivo Agar Tripticasa de Soya y Agar Sabouraud Dextrosa. El método utilizado mediante neutralización con 0,4% Polisorbato 80 y 0,5% de Lecitina de Soja. Obteniendo resultados de recuperación en el grupo de prueba entre 90,95% y 99,72% para la suspensión oral de Mebendazol de 20 mg/mL. La no toxicidad de los neutralizadores fue confirmada por la recuperación en el grupo peptona en un porcentaje de 93,53% y 103,82%. En la distribución homogénea se obtiene un 95% de confianza en la precisión, mientras que la prueba t de Student no reveló diferencias entre las pruebas y peptona. La linealidad del método en relación proporcional en UFC en los 3 grupos de análisis y sus volúmenes tomados (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 y 1,2 ml) los valores de coeficiente de 8 correlación (R2) oscilaron entre 0,9694 y 0,9932 para la suspensión de Mebendazol, estos valores cumplen lo establecido por la USP 30 que determina (R2 > 0,95). No se encontró correlación estadísticamente significativa de los cocientes lineales para los tres grupos de análisis (p ≤ 0,05). La robustez mediante el cambio de temperatura, concentración de Polisorbato de sodio 80 y medios de cultivo, los resultados de recuento microbiano no fueron estadísticamente diferentes a los obtenidos en condiciones definidas. Concluyéndose que el método de recuento microbiano validado demostró ser exacto, preciso, sólido y lineal, y puede utilizarse de forma segura en operaciones rutinarias. Arias et al. (12). En el año 2013 tuvieron como Objetivo: la validación e implementación de una metodología para el análisis microbiológico de un producto líquido preservado con parabenos, según la Farmacopea Americana edición 34, 2011. Utilizando como Método cuantitativo para recuento de microorganismos Mesófilos Aerobios, Hongos y Levaduras. Obteniendo resultados de exactitud con una recuperación superiores al 70 % tanto en presencia y ausencia de la muestra. Se obtuvo resultados de Precisión con Coeficientes de Variación menores a 35 % para todos los microorganismos de acuerdo con las especificaciones de la USP. La Precisión Intermedia entre analistas demostró Coeficientes de Variación máximos de 12,2 %. La evaluación de la Robustez tuvo una diferencia 12 UFC para microorganismos Mesófilos, entre distintos medios de cultivo y tiempos de incubación. En el parámetro de linealidad se obtienen regresiones lineales cercanos al valor teórico. Para el Límite Detección se demostró la recuperación de microorganismos Mesófilos en la dilución 10-7 en referencia al inóculo inicial después de incubarse por 24 horas, para luego determinar 9 la Especificidad con la presencia de los microorganismos. Concluyendo que la metodología mediante la neutralización con Polisorbato tiene la capacidad de brindar resultados confiables para la calidad microbiológica del producto. García et al. (13). En el año 2017 en su investigación, tuvieron como objetivo validar el esquema de neutralización por medio del aumento en el volumen de diluyente e incorporando un agente neutralizante, para eliminar la actividad antimicrobiana según la Aptitud del Método Farmacopeico (USP 39), usando como Método de vertido en placa, utilizando protocolo de validación con procedimientos basados en la Farmacopea oficial. Se analizaron los datos obtenidos con parámetros establecidos. Obteniendo resultados, el cual logró encontrar un esquema de neutralización adecuado para el Recuento Total de Hongos y Levaduras, realizando una dilución 10-1 para las Cepas Aspergillus Brasiliensis ATCC 16404 y Candida albicans ATCC 10231, neutralizando con Lecitina al 0,7 % las matrices de Amoxicilina cápsulas y Trimetoprim Sulfametoxazol suspensión. Los resultados de recuperación para Amoxicilina capsulas tuvo un porcentaje de recuperación para la cepa Candida albicans de 100,63 % y para Aspergillus Brasiliensis obtuvo 106,47%. Los resultados de recuperación para Trimetoprim Sulfametoxazol tuvo un porcentaje de recuperación de Candida albicans de 101,58 % y para Aspergillus Brasiliensis obtuvo un porcentaje de recuperación de 99,57 %. el cual ambos medicamentos cumplen con el porcentaje de Recuperación >70 %. Con respecto a la matriz de Azitromicina usando el mismo esquema de neutralización no hubo crecimiento de bacterias, hongos y Levaduras. Se demostró la eficacia del neutralizante al demostrar recuperación similar en los grupos A y B 10 en los productos Amoxicilina y Trimetoprim Sulfametoxazol, a su vez se demostró que el neutralizante no es toxico por que se obtuvo recuperación similar en los grupos B y C. Concluyendo que el método de neutralización solo es eficaz para permitir la recuperación de Aspergillus brasiliensis y Candida albicans en los ensayos de Amoxicilina y Trimetoprim en los 3 grupos de prueba. Gordon et al. (14). En el año 2017 Este artículo tuvo como Objetivo demostrar que Milliflex® Quantum produjo resultados no inferiores al método tradicional de carga biológica. Fue validado de acuerdo con la USP 1223, la Farmacopea Europea 5.1.6 y el Informe Técnico No. 33 de la Asociación de Medicamentos Parenterales y comprendió los parámetros de validación de Robustez, Solidez, Repetibilidad, Especificidad, Límite de detección y cuantificación, Exactitud, Precisión, Linealidad, Rango y equivalencia en operación rutinaria. Se utilizaron el Método filtración por membrana y recuento en placa. Los resultados se evaluaron estadísticamente según el criterio de aceptación Farmacopeica de 70 % de recuperación en comparación con el método tradicional. Los cálculos de potencia de las pruebas post hoc verificaron la idoneidad del tamaño de muestra utilizado para detectar tal diferencia. Además, las pruebas de equivalencia verificaron la no inferioridad del método rápido respecto al método tradicional. Concluyendo: Que se valida con éxito la rápida biocarga basada en Milliflex® Quantum, como método alternativo a la prueba tradicional de carga biológica. 11 ANTECEDENTES NACIONALES Sueros (15). En el año 2013 en su investigación tuvo como objetivo validar un método de ensayo cuali-cuantitativo para el análisis microbiológico del jarabe Tyrex a nivel intralaboratorial, basado en la Farmacopea Americana versión 34. Empleando el método de dilución neutralización, el cual los resultados demostraron la detección de los microorganismos de prueba en los tres grupos de tratamiento, mayor al 70 %. El Límite de Detección cuantificó 5 ufc/mL como la mínima cantidad que puede ser detectada. Los resultados de Precisión de cada analista como entre ellos obtuvieron una desviación estándar relativa menor a 0,02. El parámetro de Robustez usando distintos medios de cultivo y tiempo de incubación obtuvieron un coeficiente de variación de máximo 15%, El parámetro de Linealidad demostró coeficientes de correlación mayores de 0,95 en todas las cepas de prueba y en grupos de tratamiento. Concluyéndose que el método de neutralización permitió la recuperación y cuantificación de los microorganismos que puedan estar presente en la muestra. Morales (16). En el año 2018 tuvo como objetivo validar el examen microbiológico del Bicarbonato de Sodio y Sulfadiazina de Plata según USP vigente, mediante el Método: filtración por membrana y vertido en placa, los resultados de validación de Sulfadiazina en los 3 lotes demostró tener una Exactitud dentro del factor de 2 en comparativa al control; en la Precisión demostró que en el grupo de prueba y grupo control, no presenta variabilidad significativa en los recuentos de acuerdo al valor de la prueba “t” de Student, para el Parámetro robustez en referencia a los tiempos de incubación existe similitud en los recuentos 12 para ambos grupos, la detección de microorganismos se observó crecimiento de Staphylococcus aureus a las 24 horas y para los microorganismos Escherichia coli y Salmonella typhimurium, crecieron a las 48 horas; a su vez demostrando total crecimiento a las 72 horas de incubación. La Validación del Bicarbonato de sodio en los 3 lotes, la Exactitud evidenció recuperación dentro del factor 2 en comparativa al grupo control, la precisión de obtuvo un valor “t” > 0,05 observando que no hay variaciones en los recuentos, en el parámetro de Robustez se demuestra que el Bicarbonato de Calcio no afecta el crecimiento de los microorganismos, detectándose la cepa Escherichia coli ATCC 8739 en 24 horas, 48 horas y 72 horas de incubación. En conclusión, ambos métodos permiten el crecimiento de los microorganismos en los tiempos establecidos en la validación. Simbron et al. (17). En el año 2020 en su investigación tuvieron objetivo Validar la Aptitud del Método Microbiológico de Recuento y Microorganismos Específicos para Sulfametoxazol + Trimetoprima en Tableta Recubierta. Utilizando el método de inoculación directa y filtración por membrana, en referencia a los lineamientos de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP 42). Obteniendo resultados dentro del factor de 2 en los tres lotes de prueba, demostrando una mejor precisión para el método de inoculación directa en el caldo neutralizante, en comparación al método de filtración por membrana obtuvo una recuperación limitada y no ser de confiabilidad. Concluyéndose que el método de inoculación directa es el adecuado para el recuento y detección de microorganismos específicos. 13 2.2 Bases teóricas Dispositivo Médico Son instrumentos, aparato, máquina, programas informáticos, equipo entre otros. Utilizado solo o en combinación para el uso en pacientes para diagnosticar, prevenir, monitorear, tratar, dar soporte de alguna estructura anatómica, en la desinfección de superficies, esterilización de material médico y en investigación en la medicina (18). Clasificación de Dispositivos Médicos Los dispositivos de clase I o bajo riesgo, presentan escasa posibilidad de producir daño la salud, los de clase II o moderado riesgo están sujetas a controles generales para demostrar su seguridad, los de clase III o de alto riesgo están sujetos a un estricto control para demostrar su seguridad y los de clase IV o críticos en materia de riesgo, están destinados para dar soporte vital en pacientes enfermos (19). Control de Calidad de los Dispositivos Médicos Es un aspecto fundamental para garantizar su seguridad y eficacia. Se lleva a cabo a lo largo de todo el proceso de fabricación, desde la etapa de manufactura hasta la obtención del producto final. Este control se realiza de acuerdo con las normas y estándares de calidad establecidos a nivel nacional e internacional, al momento de la emisión del registro sanitario correspondiente. Los establecimientos públicos como privados tienen la responsabilidad de garantizar la calidad de los Dispositivos Médicos (20). 14 Amonio Cuaternario Es un compuesto cuya estructura básica es el catión Amonio (NH4+), son solubles en agua y alcohol, actúan de manera eficiente en medio alcalino, tiene atributos tensoactivos y su eficacia disminuye con la presencia de material orgánico. Presenta acción desinfectante a partir de concentraciones de 0,25%. Se utilizan en soluciones acuosas o mezclados con detergentes para potenciar su acción, generalmente asociados a aminas terciarias en su composición (21). Mecanismo de acción Actúan incrementando la permeabilidad de la membrana. Su acción bactericida actúa sobre las enzimas productoras de energía, desnaturalizando las proteínas celulares esenciales y afectando la membrana celular con la consecuente pérdida de los componentes citoplasmáticos (22). Espectro de acción Presenta actividad desinfectante sobre bacterias vegetativas, hongos y virus. Dentro de su espectro de acción presenta excelente eficacia sobre las bacterias grampositivas. No presentan acción esporicida, tuberculocida, y algunos virus pequeños (21). Tiene baja eficacia sobre las bacterias Gram negativas, como las Pseudomonas aeruginosa que crean resistencia determinado por plásmidos (23). Colección de cultivo Tipo Americano (ATCC) Fundada en 1925 para servir como centro de distribución de cultivos de microorganismos, dedicada a la preservación, autenticación y distribución de diversos materiales biológicos. 15 Actualmente es la colección de cultivos más grande del mundo, con colecciones en seis áreas: Bacteriología, Cultivo Celular, Biología Molecular, Micología, Protistología y Virología. Por lo cual cada laboratorio en su especialidad lo use para sus fines convenientes (24). Pseudomonas aeruginosa Es un patógeno oportunista que se encuentra y persiste en el medio ambiente. Esta bacteria tiene forma bacilar, perteneciente al grupo de los bacilos Gram negativos. Presenta flagelo polar que le confiere la motilidad, pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno, utilizando el Nitrógeno o Arginina como terminal de aceptación de Protones. Crece de manera eficaz en el agua y en el suelo viviendo con mínimos requerimientos nutricionales. Puede crecer entre 20° C - 43º C, se diferencia de otras especies de Pseudomonas por crecer a altas temperaturas. Pertenecen al grupo de no fermentadores de Lactosa, con la capacidad de utilizar al Acetato y Amoniaco, para obteniendo energía de la oxidación de azúcares (25). Staphylococcus aureus Es un microorganismo que en la observación microscópica se observan agrupados en racimos, la coloración de sus colonias tiene un pigmento de color dorado. Se clasifica como un coco Gram positivo, β hemolítico, Catalasa y Coagulasa positivo. Este microorganismo es parte de la flora normal de la piel de los seres humanos (26). 16 Bacillus subtilis Presenta crecimiento aerobio, según su coloración son Bacilos Gram positivos de tamaño variable (0,5 a 10 μm), crecen en pH neutro, son mesófilas (temperatura entre 30° C y 45° C), tienen la capacidad de producir endosporas con le confiere un mecanismo de resistencia a diversos tipos de ambientes (27). Candida albicans Las especies del género Candida son microorganismos que se encuentran como parte de la flora normal de piel y mucosa; en el individuo inmunocompetente se comportan como patógenos oportunistas (28), presentan forma ovoide, son unicelulares, de reproducción asexual (Fisión binaria o gemación), son pequeñas (4 - 6um), de pared delgada. Mediante la coloración Gram se tiñen de color azul oscuro. La morfología de la colonia es lisa, de color cremoso y brillante. En la identificación preliminar se observar el tubo germinal luego de 90 minutos de incubación (29). Aspergillus brasiliensis Se encuentra distribuido en la naturaleza, sus esporas se diseminan fácilmente al ambiente, crecen a temperaturas entre 6° C - 55° C y a poca humedad. Se desarrollan sobre una amplia variedad de substratos gracias a que secreta enzimas que los degradan en compuestos nutritivos útiles; son de importancia a nivel industrial como productoras de enzimas (30). Las principales características macroscópicas de las colonias: como el diámetro, textura de las colonias, pigmento difusible del anverso y reverso de las colonias en el medio de cultivo y a nivel microscópico se observan esclerocios y formas de conidióforo, entre otros (31). 17 ESTANDARIZACION DE CEPAS La finalidad de esta metodología es la obtención de una suspensión de microorganismos, el cual se obtendrá un inóculo de no mayor a 100 UFC mediante la técnica de espectrofotometría, después de un cultivo de no más de cinco pasajes de las Cepas ATCC según la tabla 1; cuya duración de uso será de 2 horas desde la estandarización o 24 horas si es que se conservan a temperatura de 2° C a 8° C, estas suspensiones se usarán para la verificación de las pruebas de Promoción de Crecimiento, Prueba de Aptitud del Método de Recuento, Límite de Detección y Validación del Método de Neutralización (32). PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a la prueba de Promoción de Crecimiento, donde se verificará que estén aptos antes de ser usados, demostrando que estos cumplen con las exigencias nutricionales que permitan el desarrollo de los microorganismos. Cada medio solido o líquido debe ser inoculado con una cantidad no mayor de 100 UFC a partir de un inóculo estandarizado (33). Para medios de cultivo sólidos, no deben diferir de un factor mayor de 2 con respecto al inóculo estandarizado y los medios de cultivo líquidos serán considerados adecuados si se observa la presencia de turbidez (34). 18 Tabla 1. Preparación y uso de Microorganismos de Prueba Aptitud del Método de Recuento en Promoción del crecimiento Presencia del Producto Recuento Total Recuento Total de Recuento Total de de Hongos Recuento Total de Hongos Microorganismos Filamentosos y Microorganismos Filamentosos y Preparación de Aerobios Levaduras Aerobios Levaduras Microorganismo cepas de Prueba Agar Digerido de Agar Digerido de Agar Digerido de Caseína y Soja o Caseína y Soja / NMP Staphylococcus Caseína y Soja y Caldo Caldo Digerido de Caldo Digerido de aureus Digerido de Caseína y Caseína y Soja Caseína y Soja ≤ 100 ATCC 6538 Soja ≤ 100 UFC 30°-35° UFC 30°-35° ≤ 3 días 18-24 horas. 30° - 35° ≤ 3 días Agar Digerido de Agar Digerido de Agar Digerido de Caseína y Soja o Caseína y Soja / NMP Pseudomonas Caseína y Soja y Caldo Caldo Digerido de Caldo Digerido de aeruginosa Digerido de Caseína y Caseína y Soja Caseína y Soja ≤ 100 ATCC 9027 Soja ≤ 100 UFC 30°-35° UFC 30°-35° ≤ 3 días 18-24 horas. 30° - 35° ≤ 3 días Agar Digerido de Agar Digerido de Agar Digerido de Caseína y Soja o Caseína y Soja / NMP Bacillus Caseína y Soja y Caldo Caldo Digerido de Caldo Digerido de subtilis Digerido de Caseína y Caseína y Soja Caseína y Soja ≤ 100 ATCC 6633 Soja ≤ 100 UFC 30°-35° UFC 30°-35° ≤ 3 días 18-24 horas. 30° - 35° ≤ 3 días Agar Sabouraud Agar Digerido de Dextrosa o Caldo Agar Digerido de Agar Sabouraud Candida Caseína y Soja ≤ 100 Agar Sabouraud Sabouraud Caseína y Soja ≤ 100 Dextrosa ≤ 100 albicans UFC Dextrosa ≤ 100 UFC Dextrosa UFC UFC ATCC 10231 30° - 35° ≤ 5 días 20° - 25° ≤ 5 días 20°- 25° 30°-35° ≤ 5 días 20°- 25° ≤ 5 días NMP: no aplica 2 - 3 días Agar Sabouraud Dextrosa o Agar Agar Digerido de Agar Digerido de Agar Sabouraud Aspergillus Papa Dextrosa Caseína y Soja ≤ 100 Agar Sabouraud Caseína y Soja ≤ 100 Dextrosa ≤ 100 brasiliensis 20°- 25° UFC Dextrosa ≤ 100 UFC UFC UFC ATCC 16404 5 – 7 días o hasta 30° - 35° ≤ 5 días 20° - 25° ≤ 5 días 30°-35° ≤ 5 días 20°- 25° ≤ 5 días alcanzar una buena NMP: no aplica esporulación Fuente: Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP NF 2023) Capitulo 61 (32). APTITUD DEL METODO Determina que el método de neutralización sea el idóneo para inhibir las sustancias de interferencia en un producto (Tabla 2), demostrando a través de la recuperación de los microorganismos de prueba (Tabla 1), en el cual no deben de diferir de un factor mayor de 2 en referencia al diluyente sin producto (32). 19 La Aptitud del método de Recuento puede demostrarse mediante tres pruebas independientes. Solo se requiere los parámetros de Validación de Exactitud y Precisión para métodos cuantitativos y cualitativos la Recuperación de Microorganismos Específicos (35; 36). ¿Por qué realizarlo? Porque se encuentra estipulado en las Normativas Nacionales e Internacionales, como en el caso de la Farmacopea Americana (USP) y es de exigencia el cumplimiento por las entidades de control regulatorio (DIGEMID), para asegurar que el método empleado en los análisis microbiológicos de productos terminados y materia prima, sean seguros y confiables (33). ¿Cuándo realizarlo? Se ejecuta cuando nunca se realizó, cuando se modifica la formulación del producto validado o cuando se modifica las condiciones experimentales del método, a su vez aplica cuando la entidad regulatoria lo exige, y en casos de que cambien las especificaciones del producto (37). INOCULACIÓN Y DILUCIÓN Agregar a la muestra preparada y a un control una suspensión de inóculo no mayor a 100 UFC. El volumen de la suspensión a inocular no debe exceder del 1% con respecto al volumen del producto diluido. Para evidenciar una recuperación microbiana aceptable, de preferencia usar la dilución de la muestra más baja para la prueba; de no ser posible la recuperación de microorganismos, debido a la presencia del antimicrobiano o la baja solubilidad, deben desarrollarse otros protocolos adecuados (32). 20 Si mediante la inoculación y dilución, hay inhibición del crecimiento, se debe modificar el procedimiento, aumentando el volumen del diluyente, incorporando agentes neutralizantes en este, cambiando la metodología mediante filtración por membrana o combinando todas las medidas anteriormente descritas (33). Neutralización / Eliminación de la Actividad Antimicrobiana Agentes neutralizantes: Se usan para neutralizar productos que contengan sustancias de interferencia (ver tabla 2). Se pueden añadir un diluyente o al medio de cultivo durante la preparación, para luego esterilizarse; debe demostrar su efectividad neutralizante y la ausencia de toxicidad para los microorganismos de prueba, con referencia con un blanco con neutralizador sin el producto (Grupo Control) (32). Para neutralizar las propiedades antimicrobianas de compuestos de Amonio Cuaternario, se puede utilizar detergentes no iónicos como el Polisorbato (Tween 80) al 3 % en combinación con Lecitina de soya al 0.3 %. El uso de estos neutralizantes puede causar que los microorganismos sean sensibles a cambios de pH, temperatura y concentraciones del Biocida (38). 21 TABLA 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Métodos para sustancias de Interferencia Sustancia de Interferencia Agentes Neutralizantes Potenciales/Método Glutaraldehído, mercuriales Sulfito acido de Sodio (Bisulfito de Sodio) Fenólicos, Alcohol, Aldehídos, Sorbato Dilución Aldehídos Glicina Compuestos de Amonio Cuaternario (CAC), Lecitina Parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas CAC, Yodo, Parabenos Polisorbato Mercuriales Tioglicolato Mercuriales, halógenos, aldehídos Tiosulfato EDTA (Edetato) Iones de Mg o Ca Fuente: Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP NF 2023) Capitulo 61 (32). Recuperación de Microorganismos en Presencia del Producto Filtración por membrana: La inoculación de estos microorganismos de prueba (< 100 UFC) se realizan en el último lavado, para evaluar que no haya presencia residual de antimicrobianos en la membrana. A su vez se debe considerar que el filtro de membrana puede inhibir el crecimiento de los microorganismos, lo cual se debe realizar controles positivos mediante el método de recuento en placa (32). Método de Recuento en placa: Esta técnica es utilizada para pruebas cuantitativas, en el cual se incorpora la muestra en placas triplicadas para obtener una media aritmética de los recuentos; se utilizan dos métodos de siembra: Vertido en placa y método de extensión por superficie (33). 22 Método del Número Mas Probable (NMP) Esta metodología no es confiable para el recuento de hongos filamentosos y reservado para el recuento total de aerobios mesófilos en los cuales no haya otra metodología disponible (39). VALIDACIÓN DEL ENSAYO MICROBIOLÓGICO Se utiliza para demostrar con evidencia objetiva que el método puede detectar o cuantificar microorganismos en distintos grupos de prueba, posterior a una prueba de idoneidad o Aptitud del método (40). La validación se realiza, cuando el método utilizado no está normalizado, cuando la técnica analítica es propia del laboratorio, cuando no pertenece a la normativa nacional, cuando se modifica el método estandarizado y por último cuando se debe demostrar la equivalencia comparable con otro método (41). VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE NEUTRALIZACIÓN Para garantizar la eficacia y la ausencia de toxicidad del neutralizante utilizado en el esquema de neutralización, se lleva a cabo un estudio de validación, el cual busca recuperar los microorganismos viables inoculados (menos de 100 UFC). Criterios de Validación: Se debe demostrar eficacia adecuada del Neutralizante, cuando existe recuperación similar de microorganismos en el Grupo de Prueba (Producto + Diluyente + Neutralizante+ Inóculo) con respecto al Grupo Control (Diluyente + Neutralizante + Inóculo), a su vez se debe demostrar la ausencia de toxicidad del Neutralizante, cuando existe recuperación similar entre el Grupo Control y el Grupo Viabilidad (Diluyente + inoculo) (42). 23 PARAMETROS DE VALIDACIÓN EXACTITUD: Es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos en referencia al valor verdadero (43). PRECISIÓN Es el grado de similitud entre los resultados de ensayos independientes realizadas a una muestra, se denota como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de análisis. Puede ser una medida del grado de reproducibilidad (diferentes laboratorios, equipos, días y analista) o de repetibilidad (un solo analista en periodos corto de tiempo) del procedimiento analítico (44). En microbiología la variabilidad del método es más amplia, el cual se considera la desviación estándar relativa en un intervalo del 15% al 35 % (35). ESPECIFICIDAD Es la capacidad del método para detectar o medir un analito, dentro de la muestra y sin interferencia de componentes (45). LÍMITE DE DETECCIÓN: Es la capacidad que tiene el método para recuperar la cantidad más baja de microorganismos en una muestra establecida (46). 24 ROBUSTEZ: Capacidad del método para no ser inalterado a modificaciones, es representativo de un indicador de su fiabilidad durante uso normal (40). 2.3 Formulación de hipótesis 2.3.1 Hipótesis General • Hipótesis nula Ho: No existe validez del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana Vigente. • Hipótesis alterna Ha: Existe validez del ensayo microbiológico de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en la Farmacopea Americana Vigente. 25 CAPÍTULO III: METODOLOGÍA 3.1 Método de la investigación El Método Hipotético – Deductivo, se caracteriza por partir de hipótesis iniciales, que a través de etapas deductivas tiene la finalidad de llegar a la realidad comprobando o refutando las hipótesis mediante la experiencia (47). 3.2 Enfoque de la investigación El enfoque Cuantitativo, son Eventos de la realidad que se quieren investigar, se verifican, se cuantifican y pueden darse o no a conocer o se utilizan de alguna manera (48). 3.3. Tipo de investigación La investigación es Aplicativa, es entendida como la utilización de los conocimientos en la práctica, para aplicarlos en provecho de los grupos que participan en esos procesos y en 26 la sociedad en general, además del bagaje de nuevos conocimientos que enriquecen la disciplina (49). 3.4. Diseño de la investigación El diseño experimental, se caracteriza por una asignación aleatoria probabilística de los participantes en el grupo experimental y control (50). 3.5. Población, muestra y muestreo Población: 9 Litros con solución de Amonio Cuaternario al 0,25 %. Criterios de inclusión: Solución de Amonio Cuaternario al 0,25 % de 1 litro. Criterios de exclusión: Solución de Amonio Cuaternario al 0,25 % en presentaciones de 4 Litros. Muestra: 200 mL de solución de Amonio Cuaternario al 0,25 %. Muestreo: No probabilístico - Por conveniencia. 27 3.6. Variables y operacionalización Variable 1: Validación Definición Operacional: Proceso mediante el cual se demuestra que las características de desempeño del método son aptas para las aplicaciones analíticas previstas en comparación a los estándares de referencia. Definición Escala de Escala valorativa Dimensión Definición conceptual Indicador operacional medición (Niveles o rangos) Estandarización de Metodología por el cual se busca obtener una suspensión con El criterio se basará en la Cumple: < 100 UFC Recuento de UFC Razón cepas un inóculo de concentración conocida USP NF 2023 No cumple: > 100 UFC Recuento de UFC Razón Cumple: No difiere Factor mayor de 2 Promoción de Prueba que verifica que los medios de cultivo se encuentren La verificación se basará en Cumple: Presencia de crecimiento crecimiento aptos para recuperar microorganismos. la USP NF 2023 No cumple: difiere Factor mayor de 2 Crecimiento Nominal No cumple: ausencia de crecimiento Determina que el método de neutralización sea el idóneo para Recuento de UFC Razón Cumple: No difiere Factor mayor de 2 inhibir las sustancias de interferencia en un producto, La determinación se basará Cumple: Presencia de Crecimiento de Microorganismos específicos Aptitud del Método demostrando a través de la recuperación de los en la USP NF 2023 No cumple: Factor mayor de 2 Crecimiento Nominal microorganismos de prueba. No cumple: Ausencia de crecimiento de Microorganismos específicos Efectividad del Método empleado en el cual la Neutralización es eficaz para El criterio se basará en la Cumple: μ Grupo Prueba (A) = μ Grupo control (B) Neutralizante inhibir las propiedades antimicrobianas del producto. USP NF 2023 Recuento de UFC Razón No cumple: μ Grupo Prueba (A) ≠ μ Grupo control (B) Toxicidad del Método empleado en el cual se permite la recuperación de El criterio se basará en la Cumple: μ Grupo Control (B) = μ Grupo Viabilidad (C) Recuento de UFC Razón Neutralizante microorganismos Viables USP NF 2023 No cumple: μ Grupo Control (B) ≠ μ Grupo Viabilidad (C) Cumple: Factor 2 se encuentra dentro de los límites del Intervalo de Proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos en La Determinación se basará confianza al 90%. Exactitud Recuento de UFC Razón referencia al valor verdadero. en la USP NF 2023 No cumple: Factor no se encuentra dentro de los límites del intervalo de confianza al 90% Es el grado de similitud entre los resultados de ensayos La Determinación se basará Cumple: Coeficiente de variación < 15% Precisión independientes realizadas a una muestra. en la USP NF 2023 Recuento de UFC Razón No Cumple: Coeficiente de variación > 15 % Es la capacidad del método para detectar o medir un analito, La Determinación se basará Cumple: μ Grupo prueba = μ Grupo control Especificidad Recuento de UFC dentro de la muestra y sin interferencia de sus componentes. en la USP NF 2023 Razón No cumple: μ Grupo prueba ≠ μ Grupo control Es la capacidad que tiene el método para recuperar la cantidad La Determinación se basará Cumple: Existe crecimiento > 90 % Límite de Detección Crecimiento Nominal más baja de microrganismo en una muestra. en la USP NF 2023 No cumple: crecimiento < 90 % Cumple: Conteo promedio de UFC de RTMA de 3 días = Conteo promedio de UFC de RTMA a los 5 días Es la capacidad del método para no ser inalterado a Conteo promedio de UFC de RTHL de 5 días = Conteo promedio de La Determinación se basará UFC de RTHL a los 7 días Robustez modificaciones, es representativo de un indicador de su Recuento de UFC Razón en la USP NF 2023 No Cumple: fiabilidad durante su uso normal. Conteo promedio de UFC de RTMA de 3 días ≠ Conteo promedio de UFC de RTMA a los 5 días Conteo promedio de UFC de RTHL de 5 días ≠ Conteo promedio de UFC de RTHL a los 7 días 28 3.7. Técnicas e instrumentos de recolección de datos 3.7.1. Técnica Para el ensayo de validación de este Dispositivo Médico, la técnica de referencia se basó en el capítulo 61 y 62 de la Farmacopea Americana NF 2023; los resultados obtenidos se transfirieron al programa estadístico SPSS Statistics 27 y Minitab 21 para desarrollar los parámetros de validación, basado en el capítulo 1223 y Capitulo 1227 de la mencionada obra oficial. 3.7.1.1 PROCEDIMIENTO 3.7.1.1.1 Estandarización de cepas ⮚ A partir de un Cultivo de cada microorganismo y con un asa de siembra se inoculó en un tubo con 10 mL de medio de Caldo Tripticasa de Soya, las cepas Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli 8739 y Bacillus subtilis ATCC 6633 durante 24 horas entre 30° C - 35 °C y para el cultivo de Candida albicans ATCC 10231 se inoculó con un asa de siembra a un tubo con 10 mL de Caldo Sabouraud y se incubó durante 48 - 72 horas entre 20° C - 25° C. El cultivo de Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 se suspendió con 10 ml de Buffer Peptona con 0,05% de Polisorbato 80 hasta completar los 50 ml en un frasco con tapa rosca estéril. ⮚ Se transfirieron 0,1 mL de cada suspensión obtenida a 9,9 ml de buffer Peptona, solo para el caso de Aspergillus brasiliensis se transfirió aproximadamente 0,5 ml de la suspensión recolectada a 9,5 ml de Buffer Peptona con 0,05% de Polisorbato 80. 29 ⮚ La suspensión de cada microorganismo (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis y Candida albicans) se midió al espectrofotómetro con una longitud de onda de 560 nm y a una absorbancia entre 0,050 a 0,075 y para el caso de Aspergillus brasiliensis en una absorbancia aproximada de 0,27 para obtener un recuento menor de 100 ufc/ml. ⮚ Se realizó diluciones seriadas hasta 10-6 para las cepas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6633 y Escherichia coli ATCC 8739; para Bacillus subtilis ATCC 6633 hasta la dilución 10-5; para los microorganismos Candida albicans ATCC 10231 y Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 se realizaron las diluciones seriadas hasta 10-4. ⮚ Se agregó de la última dilución de cada microorganismo 1ml a una placa Petri (se realizó en 5 placas repetidas) y se incorporó Agar Tripticasa de Soya para las cepas (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus subtilis) se homogenizó e incubó entre 30° C - 35° C por 72 horas. Para los microorganismos Candida albicans y Aspergillus brasiliensis se incorporó Agar Sabouraud Dextrosa y se incubó de 20° C - 25° C por 5 días, y se determinó las diluciones con menos de 100 UFC/mL. Figura 1. ⮚ Se registró el recuento en la ficha de recolección de datos de estandarización de cepas. 30 Figura 1. Esquema de Estandarización de Cepas de Prueba Fuente: Elaboración propia 31 3.7.1.1.2 PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO ⮚ Se prepararon los medios de cultivo Agar Digerido de Caseína y Soja, Agar Sabouraud Dextrosa, Caldo Digerido de Caseína y Soja y Caldo Sabouraud Dextrosa como indica el fabricante. ⮚ Para medios de cultivo solidos se agregó de 15 - 20 mL de Agar estéril a placas Petri a una temperatura aproximada de 45° C - 50° C y se dejó solidificar; para el caso de medios de cultivo líquidos estériles se preparó alícuotas 9,9 mL en tubos estériles. ⮚ Se inoculó a los medios sólidos y líquidos, un inóculo de microorganismos (no más de 100 UFC) los cuales están indicados en la Tabla 1. Estas suspensiones de cepas de prueba se deben usar dentro de las 2 horas o 24 horas si se almacena a una temperatura de 2° C a 8° C. ⮚ Con una espátula de Drigaslky distribuyó el Inóculo en toda la superficie del medio y se incubó las placas de 30° C - 35° C por 72 horas para Microorganismos Aerobios Mesófilos y para Hongos y Levaduras se incubó de 20° C - 25° C durante 5 días. ⮚ Se registró la recuperación de los microorganismos en el Formato de Registro de la Prueba de Promoción e Inhibición de Crecimiento de Medios de Cultivo. 32 Propiedades Indicadoras de Promoción del crecimiento e Inhibitorias de los Medios de Cultivo ⮚ Se prepararon los medios de cultivo Agar Manitol Salado y Agar Cetrimide como indica el fabricante. Se agrego de 15 - 20 mL de Agar estéril a placas Petri a una temperatura aproximada de 45° C - 50° C y se dejó solidificar. ⮚ Se seleccionó e incubó los microorganismos de prueba (no más de 100 UFC) correspondientes a los medios indicados en la Tabla 3. con la ayuda de una espátula de Drigaslky se distribuyó e Inoculó en toda la superficie del medio. Se incubó las placas invertidas de 30° C a 35° C durante 72 horas y a 20° C - 25° C durante 5 días para Levaduras. ⮚ Se registró la recuperación de los microorganismos en el Formato de Registro de la Prueba de Promoción e Inhibición de Crecimiento de Medios de Cultivo. Tabla 3. Propiedades Indicadoras de Promoción del crecimiento e Inhibitorias de los medios de cultivo Prueba / Medio Propiedad Cepas de Prueba Prueba de Pseudomonas aeruginosa Promoción de crecimiento Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimide Inhibitoria Escherichia coli Prueba de Staphylococcus aureus Promoción de crecimiento Staphylococcus aureus Agar Manitol Salado Inhibitoria Escherichia coli Prueba de Candida albicans Caldo Sabouraud Dextrosa Promoción de crecimiento Candida albicans Promoción del crecimiento + Candida albicans Agar Sabouraud Dextrosa Indicadora Fuente: Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP NF 2023) Capitulo 62 (36). 33 3.7.1.1.3 APTITUD DEL MÉTODO A. PREPARACIÓN DE GRUPOS DE PRUEBA A.1 PREPARACIÓN DEL GRUPO DE PRUEBA (A) ⮚ Se realizó una dilución 1/10 y 1/100 en caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%), tomando 10 mL de muestra a evaluar. Se Homogenizó y se distribuyó con una pipeta estéril 9,9 mL de las diluciones realizadas del Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) a tubos estériles (ver Figura 2). Se rotuló cada tubo correspondiente con el nombre de los microorganismos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. A.2 PREPARACIÓN DEL GRUPO CONTROL (B) ⮚ A partir del medio cultivo estéril Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4 %). Se distribuyó con una pipeta estéril, 9,9 mL a tubos estériles (Figura 2). Se rotuló cada tubo correspondiente con el nombre de los microorganismos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subitilis, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. A.3 INOCULACIÓN ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la suspensión de trabajo que contenga menos de 100 UFC de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis al tubo rotulado con el nombre de cada Microorganismo y se homogenizó. 34 A.4 CONTROL NEGATIVO ⮚ Se realizó el control del medio de Cultivo Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0.5%) Polisorbato 80 (4%) y se incubó de 30º C a 35º C por 24 a 72 horas. ⮚ Adicionalmente se realizó el control negativo del Agar Tripticasa de Soya, incorporando 15 a 20 mL del medio de cultivo enfriado a 45ºC aproximadamente. Se dejó solidificar a temperatura ambiente y se incubó de 30º C a 35º C por 24 a 72 horas. Asu vez se realizó el control negativo del Agar Sabouraud Dextrosa incorporando 15 a 20 mL del medio de cultivo enfriado a 45º C aproximadamente. Se dejó solidificar a temperatura ambiente y se incubó de 20º C a 25º C por 3 a 5 días. B. RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS (Método de Recuento en Placa) B.1 RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS (RTMA) ⮚ Se pipeteó 1 mL del tubo rotulado como Pseudomonas aeruginosa a placas Petri estériles (por triplicado), se realizó la misma acción para los microorganismos Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, finalmente a cada placa se incorporó 15 a 20 mL de Agar Tripticasa de Soya enfriado a 45º C aproximadamente. Se realizó movimientos rotatorios y se dejó solidificar a temperatura ambiente. Se incubó todas las placas a la temperatura de 30ºC a 35ºC por 72 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se contó el número de colonias por placa y se obtuvo el promedio y expresó el resultado en Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/mL). 35 ⮚ Los resultados se registraron en el formato de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos específicos. B.2 RECUENTO TOTAL DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS (RTHL) ⮚ Se pipeteó 1mL del tubo rotulado como Candida albicans a placas Petri estériles (por duplicado), se realizó la misma acción para el microorganismo Aspergillus brasiliensis, finalmente a cada placa se incorporó 15 a 20 mL de Agar Sabouraud Dextrosa enfriado a 45º C aproximadamente. Se realizó movimientos rotatorios, dejar solidificar a temperatura ambiente. Se incubó todas las placas a la temperatura de 20º C a 25º C por 5 días. Transcurrido el tiempo de incubación se contó el número de colonias por placa y se obtuvo el promedio y expresó el resultado en Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/mL). ⮚ Los resultados se registraron en el formato de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos específicos. C. MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS C.1 PREPARACIÓN DEL GRUPO DE PRUEBA (A) ⮚ Se realizó una dilución 1/10 en caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) tomando 10 mL de muestra y se homogenizó. De la dilución realizada se transfirió 10 mL a otro envase que contenga 90 mL de caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) y se homogenizó. 36 ⮚ Se distribuyó con una pipeta estéril 9,9 mL del envase de la segunda dilución a dos tubos estériles y se Rotuló como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. C.2 PREPARACIÓN DEL GRUPO CONTROL (B) ⮚ A partir del medio de cultivo Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%). Se distribuyo con una pipeta estéril 9,9 mL a dos tubos estériles y se rotuló como Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. C.3 INOCULACION ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la suspensión de trabajo que contiene menos de 100 UFC de Pseudomonas aeruginosa al tubo rotulado con el nombre del microorganismo y se incubó de 30º C a 35º C por 18 a 24 horas. ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la suspensión de trabajo que contiene menos de 100 UFC de Staphylococcus aureus al tubo rotulado con el nombre del microorganismo y se incubó de 30º C a 35º C por 18 a 24 horas. C.4 CONTROL NEGATIVO ⮚ Se realizó los controles negativos para el medio de cultivo: Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) y se incubó los tubos de 30º C - 35º C por 18 a 24 horas. Finalizado el periodo de incubación se observó la ausencia de turbidez de cada uno de los tubos. 37 C.5 SELECCIÓN Y SUBCULTIVO: C.5.1 MICROORGANISMO: Pseudomonas aeruginosa ⮚ Mediante un asa de siembra subcultivo por estría y agotamiento del tubo de Prueba, el tubo del Grupo control y el control negativo a una placa conteniendo Agar Cetrimide y se incubó a una temperatura de 30º C - 35º C por 18 a 72 horas. C.5.2 MICROORGANISMO: Staphylococcus aureus ⮚ Mediante un asa de siembra subcultivo por estría y agotamiento del tubo de Prueba, el tubo del Grupo control y el control negativo a una placa conteniendo Agar Manitol salado y se incubó a una temperatura de 30º C - 35º C por 18 a 72 horas. 38 FIGURA 2. Esquema de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos Fuente: Elaboración propia 3.7.1.1.4 DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN A. PREPARACIÓN DEL GRUPO DE PRUEBA (A) ⮚ Se realizó una dilución 1/10 en caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) tomando 20 mL de muestra y luego se homogenizó. De la dilución realizada se transfirió 20 mL a otro envase que contuvo 180 mL de caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) y se homogenizo. ⮚ Se distribuyó con una pipeta estéril, 9,9 mL del envase de la segunda dilución a 20 tubos estériles y se rotularon como Staphylococcus aureus. 39 ⮚ Se Distribuyó con una pipeta estéril, 9,9 mL del envase de la segunda dilución a 20 tubos estériles y se rotularon como Pseudomonas aeruginosa. B. PREPARACIÓN DEL GRUPO CONTROL (B) ⮚ Previamente se incorporó 20 ml de Buffer Peptona al medio de cultivo Caldo Tripticasa Soya Lecitina (0,5%) Polisorbato 80 (4%) y se homogenizó. ⮚ Se distribuyó con una pipeta estéril 9,9 a 20 tubos estériles y se rotularon como Staphylococcus aureus. ⮚ Se distribuyó con una pipeta estéril 9,9 mL a 20 tubos estériles y se rotularon como Pseudomonas aeruginosa. C. INOCULACIÓN C.1 Inoculación de Pseudomonas aeruginosa: ⮚ Se realizó 3 diluciones sucesivas al medio a partir de la suspensión del Inóculo estandarizado. (Figura 3.) ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la suspensión de trabajo que contiene menos de 100 UFC de Pseudomonas aeruginosa a 5 tubos rotulados con el nombre del microorganismo. ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 1 (Dil 1) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 2 (Dil 2) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 3 (Dil 3) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se incubaron todos los tubos de 30º C - 35º C por 18 a 24 horas. 40 C.2 inoculación de Staphylococcus aureus ⮚ Se realizó 3 diluciones sucesivas al medio a partir de la suspensión del Inóculo estandarizado. (Figura 3.) ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución de trabajo 10-4 de Staphylococcus aureus a 5 tubos rotulados con el nombre del microorganismo. ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 1 (Dil 1) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 2 (Dil 2) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se adicionó 0,1 mL de la dilución 3 (Dil 3) a 5 tubos rotulados con la dilución respectiva ⮚ Se incubó todos los tubos de 30º C - 35º C por 18 a 24 horas. Figura 3. Esquema del Límite de Detección Fuente: Elaboración propia 41 3.7.1.1.5 VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE NEUTRALIZACIÓN Para la Validación del método de neutralización, al Grupo de Prueba (A) y al Grupo Control (B) se adicionó el Grupo Viabilidad (C) para determinar la ausencia de la Toxicidad del neutralizante, en el cual se realizaron 3 ensayos independientes en tres lotes del producto. A. PREPARACIÓN DEL GRUPO VIABILIDAD (C) ⮚ A partir del medio de cultivo Caldo Tripticasa Soya sin presencia de neutralizantes, se realizó lo siguiente: ⮚ Se distribuyó con una pipeta estéril, 9,9 mL a tubos estériles (Figura 4). Se rotuló cada tubo correspondiente con el nombre de los microorganismos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subitilis, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. B. INOCULACIÓN. ➢ Se adicionó 0,1 mL de la suspensión de trabajo que contuvo menos de 100 UFC de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis al tubo rotulado con el nombre de cada Microorganismo y homogenizar. ➢ Para la recuperación de los microorganismos para este grupo, se siguió el procedimiento a partir del Ítem 3.7.1.1.3 B ➢ Para el desarrollo del parámetro de robustez se incubó dos días adicionales para cada grupo de microorganismos. 42 Figura 4. Esquema de Validación del Método de Neutralización Fuente: Elaboración Propia 3.7.2. Descripción de instrumentos Se registró los datos en los siguientes formatos: ⮚ Ficha de Recolección de Datos de Estandarización de Cepas de Prueba. ⮚ Formato de registro de la prueba de Promoción e Inhibición de Crecimiento de Medios de Cultivo. 43 ⮚ Formato de registro de la Prueba de la Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos. ⮚ Formato de Límite de Detección ⮚ Formato de Validación de Método de Neutralización en Grupos de Tratamiento. 3.7.3 Validación La validación de los instrumentos se realizó por el juicio de 3 expertos. 3.7.4. Confiabilidad No aplica por ser una ficha de recolección de datos. 3.8. Plan de procesamiento y análisis de datos Los resultados de recuento de UFC y turbidez de los medios de cultivo se registraron a los instrumentos respectivos: ⮚ Ficha de Recolección de Datos de Estandarización de Cepas de Prueba. ⮚ Formato de registro de la prueba de Promoción e Inhibición de Crecimiento de Medios de Cultivo. ⮚ Formato de registro de la Prueba de la Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos. ⮚ Formato de Límite de Detección ⮚ Formato de Validación de Método de Neutralización en Grupos de Tratamiento. 44 ❖ Estandarización de Cepas Para el logro de este objetivo se desarrolló el procedimiento a partir del Ítem 3.7.1.1.1, se promedió las 5 repeticiones (recuento en placa), el cual obtuvo un promedio de UFC de la suspensión estandarizada. Criterio de aceptación: El recuento de los microorganismos de Prueba debe corresponder a una Inóculo estandarizado menor de 100 UFC/ mL. ❖ Prueba de Promoción de Crecimiento y Propiedades Indicadoras e Inhibitorias de los medios de cultivo Para verificar la conformidad del medio de cultivo preparado, se realizará el procedimiento de la prueba de Promoción a partir del ítem 3.7.1.1.2. Los resultados se registraron en el Formato de registro de Prueba de Promoción e Inhibición de crecimiento de medios de cultivo, el cual cumplió los siguientes criterios de aceptación del medio de cultivo. 45 Tabla 4. Criterios de aceptación de Prueba de Promoción de Crecimiento y Propiedades Indicadoras e Inhibitorias de los medios de cultivo. Prueba Criterio de aceptación Promoción en medios de cultivo solido Factor no mayor de 2 Promoción en medios de cultivo líquido Turbidez Medio de cultivo Cepas de prueba Propiedades Agar Cetrimide Escherichia coli Ausencia de Crecimiento Inhibitorias Agar Manitol Salado Escherichia coli Medio de cultivo Cepas de prueba Agar Cetrimide Pseudomonas aeruginosa Presencia de crecimiento Propiedades Agar Manitol Salado Staphylococcus aureus (Turbidez) Indicadoras Agar Sabouraud Dextrosa Candida albicans Fuente: Elaboración Propia ❖ Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos Para el cálculo de la interpretación de los resultados, previamente se realizó el procedimiento de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos específicos del Ítem 3.7.1.1.3 46 Tabla 5. Criterios de aceptación de la Prueba de Aptitud del Método de Recuento y Microorganismos Específicos Prueba Criterio de aceptación Grupo de Prueba con respecto al Aptitud del Método de Recuento Grupo Control no difiere en un Factor mayor de 2 ( 50% - 200 %). Grupo de Estudio Microorganismo Pseudomonas aeruginosa Grupo de Prueba (A): Prueba de Staphylococcus aureus Crecimiento (Turbidez) Microorganismos Pseudomonas aeruginosa Específicos Grupo Control (B): Staphylococcus aureus Control Negativo: No aplica Ausencia de Crecimiento Microorganismo Medio Selectivo Selección y Subcultivo Pseudomonas aeruginosa Agar Cetrimide Colonias verdosas Staphylococcus aureus Agar Manitol Salado Colonias amarillas Fuente: Propia ❖ Determinación del Límite de Detección Para determinar del criterio de aceptación, se realizó el procedimiento del Límite de Detección para Microorganismos específicos del Ítem 3.7.1.1.4 Interpretación: Turbidez en las 5 réplicas simultaneas de cada dilución que permita el crecimiento, lo cual establecerá el límite mínimo de recuperación de microrganismos en los Grupos de ensayo no menor del 90 % (46). 47 PROCESAMIENTO DE PARAMETROS ESTADISTICOS Luego los resultados se trasladaron en la plataforma estadística SPSS Versión 27 y Minitab para el desarrollo de los parámetros de Validación. Tabla 6. Procesamiento de Parámetros Estadísticos PRUEBA Y PARAMETROS CALCULO ESTADISTICO Estandarización de cepas No aplica Promoción de Crecimiento No aplica No aplica Aptitud del Método de Recuento Prueba t para comparación de dos medias independientes a nivel de significancia de 5 % Efectividad del Neutralizante Bilateral: μ Grupo Prueba = μ Grupo Control Prueba t para comparación de dos medias independientes a nivel de significancia de 5 % Toxicidad del Neutralizante Bilateral: μ Grupo Control = μ Grupo Viabilidad Exactitud Cumple: Factor 2 se encuentra dentro de los límites del Intervalo de confianza al 90%. Precisión (Repetibilidad) C.V. menor al 15 % Especificidad μ Grupo prueba = μ Grupo Control Límite de detección No aplica Prueba t para comparación de dos medias emparejadas a nivel de significancia de 5 % Robustez Bilateral: μ Grupo Prueba = μ Grupo Control μ Grupo Control = μ Grupo Viabilidad Fuente: Elaboración Propia 3.9. Aspectos éticos Se trabajó con equipos calibrados, calificados y materiales que forman parte del Laboratorio. No existen problemas éticos ni morales. La información de la formulación y lotes del producto para esta investigación se mantiene en reserva de acuerdo con las políticas de confidencialidad de la empresa. 48 CAPÍTULO IV: PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 4.1. Resultados 4.1.1. Análisis descriptivos de resultados De acuerdo con el Objetivo específico 1: ESTANDARIZACION DE CEPAS Tabla 7. Estandarización de cepas de prueba ESTANDARIZACIÓN DE CEPAS MICROBIOLÓGICAS Pseudomonas Staphylococcus Escherichia Bacillus Candida Aspergillus aeruginosa aureus coli subtilis albicans brasiliensis Diluciones 10-4 10-5 10-6 10-4 10-5 10-6 10-4 10-5 10-6 10-3 10-4 10-5 10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4 Fecha 9 x 103 9.x 102 86 7 x 103 7 x 102 65 9 x 103 9 x 102 85 6 x 103 6 x 102 60 8 x 103 8 x 102 82 5 x 103 5 x 102 53 12-.01-24 8 x 103 8 x 102 81 7 x 103 7 x 102 70 9 x 103 9 x 102 86 6 x 103 6 x 102 62 9 x 103 9 x 102 85 5 x 103 5 x 102 48 8 x 103 8 x102 84 7 x 102 7 x 102 67 9 x 103 9 x 102 87 6 x 10 3 6 x 102 60 9 x 103 9 x 102 87 5 x 103 5 x 102 50 9 x 10 3 9 x 102 85 7 x 103 7 x 102 69 8 x 103 8 x 102 84 6 x 103 6 x 102 58 8 x 103 8 x 102 80 5 x 103 5 x 102 52 8 x 102 8 x 102 82 7 x 103 7 x 102 66 8 x 103 8 x 102 83 6 x 103 6 x 102 61 9 x 103 9 x 102 85 5 x 103 5 x 102 51 Promedio 9 x 10 3 9 x 101 84 7 x 103 7 x 102 67 9 x 103 9 x 102 85 6 x 102 6 x 102 60 9 x 103 8 x 102 84 5 x 103 5 x 102 51 UFC/mL Absorbancia 0,060 0,075 0,065 0,050 0,050 0,250 Fecha 8 x 103 8 x 102 83 6 x103 6 x 102 64 6 x 103 6 x 102 64 8 x 103 8 x 102 83 5 x 103 5 x 102 52 19-01-24 8 x 103 8 x 102 84 6 x103 6 x 102 62 6 x 103 6 x 102 60 8 x 103 8 x 102 82 5 x 103 5 x 102 49 9 x 103 9 x102 85 6 x103 6 x 102 63 No aplica 6 x 103 6 x 102 63 8 x 103 8 x 102 80 5 x 103 5 x 102 47 8 x 103 8 x 102 82 7 x 103 7 x 102 65 6 x 103 6 x 102 64 8 x 103 8 x 102 84 5 x 103 5 x 102 48 8 x 103 8 x 102 82 6 x103 6 x 102 61 6 x 103 6 x 102 63 8 x 103 8 x 102 81 5 x 103 5 x 102 50 3 2 Promedio 8 x 10 8 x 10 83 6 x 10 3 7 x 102 63 No aplica 6 x 103 6 x 102 63 8 x 103 8 x 102 81 5 x 103 5 x 102 49 UFC/mL Absorbancia 0,059 0,074 0,050 0,051 0,251 49 Fecha 8 x 103 8 x 102 83 6 x103 6 x 102 60 7 x 103 7 x 102 66 9 x 103 9 x 102 85 5 x 103 5 x 102 54 24-01-24 8 x 103 8 x 102 84 6 x103 6 x 102 64 6 x 103 6 x 102 62 9 x 103 9 x 102 86 6 x 103 6 x 102 56 9 x 103 9 x102 85 7 x103 7 x 102 65 No aplica 7 x 103 7 x 102 65 8 x 103 8 x 102 83 6 x 103 6 x 102 57 8 x 103 8 x 102 82 6 x 103 6 x 102 62 7 x 103 7 x 102 67 8 x 103 8 x 102 82 5 x 103 5 x 102 53 8 x 103 8 x 102 82 7 x103 7 x 102 66 7 x 103 7 x 102 65 9 x 103 9 x 102 86 6 x 103 6 x 102 55 3 2 3 Promedio 8 x 10 8 x 10 83 6 x 10 6 x 10 2 63 No aplica 7 x 103 7 x 102 65 9 x 103 9 x 102 84 6 x 103 6 x 102 55 UFC/mL Absorbancia 0,060 0,075 0,050 0,051 0,249 Interpretación: Se observa que el recuento de microorganismos en la mayor dilución presentó un recuento menor a 100 unidades formadoras de colonias. Tabla 8. Suspensión de trabajo Prueba Promoción de crecimiento Aptitud del Método/ Validación 10-5 10-5 10-5 10-4 10-3 -3Dilución 10 10- 4 10-4 10-3 10-2 10-2 Microorganismo PS ST EC Bs Cd Asp PS ST BS Ca Asp 9.x 102 7 x 102 9 x 102 6 x 102 8 x 102 5 x 102 8 x 102 7 x 102 9 x 102 6 x 102 9 x 102 5 x 102 8 x102 7 x 102 9 x 102 6 x 102 9 x 102 5 x 102 No aplica Fecha:12-01-24 9 x 102 7 x 102 8 x 102 6 x 102 8 x 102 5 x 102 8 x 102 7 x 102 8 x 102 6 x 102 9 x 102 5 x 102 Promedio 9 x 102 7 x 102 9 x 102UFC/mL 6 x 10 2 8 x 102 5 x 102 8 x 103 6 x103 6 x 103 8 x 103 5 x 103 8 x 103 6 x103 6 x 103 8 x 103 5 x 103 No aplica 9 x 103 6 x103 6 x 103 8 x 103 5 x 103 Fecha: 19-01-24 3 3 8 x 10 7 x 10 6 x 10 3 8 x 103 5 x 103 8 x 103 6 x103 6 x 103 8 x 103 5 x 103 Promedio UFC/mL 8 x 10 3 6 x 103 6 x 103 8 x 103 5 x 103 8 x 103 6 x103 7 x 103 9 x 103 5 x 103 8 x 103 6 x103 6 x 103 9 x 103 6 x 103 No aplica 9 x 103 7 x103 7 x 103 8 x 103 6 x 103 Fecha: 24-01-24 8 x 103 6 x 10 3 7 x 103 8 x 103 5 x 103 8 x 103 7 x103 7 x 103 9 x 103 6 x 103 Promedio UFC/mL 8 x 10 3 6 x 103 7 x 103 9 x 103 6 x 103 (Ps) Pseudomonas aeruginosa (St) Staphylococcus aureus (Ec) Escherichia coli (Bs) Bacillus subtilis (Cd) Candida albicans (Asp) Aspergillus brasiliensis 50 Interpretación: Se seleccionó las diluciones que presentaron un recuento referencial menor a 100 UFC/mL con respecto a la dilución estandarizada. 51 De acuerdo con el Objetivo específico 2: PROMOCIÓN E INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO Tabla 9. Recuperación de microorganismos en medios de cultivo CEPAS DE PRUEBA Pseudomonas Staphylococcu Bacillus Candida Aspergillus Control Medio de aeruginosa s aureus subtilis albicans brasiliensis negativo cultivo ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC 6633 ATCC 10231 ATCC 16404 Fecha: 12-01-24 Recuento de inóculo Estandarizado 84 UFC 67 UFC 60 UFC 84 UFC 51 UFC Agar Tripticasa - de soya Promoción de crecimiento 82 UFC 58 UFC 56 UFC 95,2 UFC 48 UFC Resultados (50 % - 200 %) 98 % 87 % 93,3% 97,4% 95 % Agar Recuento de inóculo Estandarizado N/A N/A N/A 84 UFC 51 UFC Sabouraud Promoción de crecimiento N/A N/A N/A 82 UFC 47 UFC - Dextrosa Resultados (50 % - 200 %) - - - 98% 92% Caldo Recuento de inóculo Estandarizado 84 UFC 67 UFC 60 UFC 84 UFC 51 UFC Tripticasa de soya + Promoción de crecimiento + + + + + - Neutralizantes Resultados (50 % - 200 %) N/A N/A N/A N/A N/A Caldo Recuento de inóculo Estandarizado 84 UFC 67 UFC 60 UFC 84 UFC 51 UFC Tripticasa de Promoción de crecimiento + + + + + soya Resultados (50 % - 200 %) N/A N/A N/A N/A N/A Recuento de inóculo Estandarizado 84 UFC 67 UFC 60 UFC 84 UFC 51 UFC Buffer Peptona Promoción de crecimiento + + + + + Resultados (50 % - 200 %) N/A N/A N/A N/A N/A Medios líquidos: (+) Presencia de Crecimiento ( - ) Ausencia de Crecimiento ( / ) No aplica Interpretación: Se observan que los medios de cultivo preparados permitieron el crecimiento de los microorganismos inoculados, el cual los resultados se encontraron dentro porcentaje de recuperación del 50% - 200 % (Factor 2) y para medios líquidos presentaron crecimiento o turbidez. 52 Tabla 10. Propiedades Indicadoras de Promoción de crecimiento e Inhibición de los medios de cultivo. Pseudomonas Staphylococcus Escherichia Control Medios de Cultivo aeruginosa aureus coli negativo ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC 8739 Fecha: 12-01-24 Recuento de inóculo 85 UFC 67 UFC 85 UFC Estandarizado Agar Manitol Promoción de N/A 65 UFC N/A crecimiento - salado Resultados N/A 97 % N/A (50 % - 200 %) Prueba Inhibitoria N/A N/A - Recuento de inóculo 85 UFC 67 UFC 85 UFC Estandarizado Agar Cetrimide Promoción de 80 UFC N/A N/A crecimiento - Resultados 106,3 % N/A N/A (50 % - 200 %) Prueba Inhibitoria N/A N/A - Medios líquidos: (+) Presencia de Crecimiento ( - ) Ausencia de Crecimiento ( / ) No aplica Interpretación: Se observa que la recuperación de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus se encontraron dentro del Factor no mayor de 2 para medios selectivos y presentaron inhibición del microorganismo Escherichia coli en ambos medios de cultivo. 53 De acuerdo con el Objetivo específico 3: APTITUD DEL METODO EN PRESENCIA DEL PRODUCTO Tabla 11. Recuperación de Microorganismos en presencia del producto / Ensayo 1 A B A/B Control Grupo de Prueba Grupo Control Negativo (UFC/mL) (UFC/mL) Muestra + Diluyente + Neutralizante + Diluyente + Neutralizante + % Inóculo Inóculo Caldo Nro.de CEPAS ATCC Recuperación ensayo: 1 Recuento de Recuento de Factor Tripticasa de (50% - 200%) UFC/mL UFC/mL Soya Promedio de Promedio de Lecitina (0,5 %) Placa Placa Placa UFC/mL Placa Placa Placa UFC /mL Polisorbato 80 1 2 3 1 2 3 (4%) Pseudomonas aeruginosa 88 89 81 86,00 85 86 84 85 1,01 - 101% ATCC 9027 Amonio Staphylococcus aureus 00 00 00 0,0 65 58 62 61,7 0,00 - 0% cuaternario ATCC 6538 Bacillus subtilis 00 00 00 0,0 57 66 63 62 0,00 - 0% Lote 1 ATCC 6633 Dilución 10-1 Candida albicans 88 80 85 84,3 87 84 86 85,7 0,98 - 98% ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 53 52 48 51 57 51 54 54 0,94 - 94% ATCC 16404 Pseudomonas aeruginosa 81 83 83 82,3 85 86 84 85 0,97 - 97% ATCC 9027 Staphylococcus aureus Amonio 62 64 60 62 65 58 62 61,7 1,01 - 101% ATCC 6538 cuaternario Bacillus subtilis 58 56 58 57,3 57 66 63 62 0,92 - 92% ATCC 6633 Lote 1 -2 Candida albicans Dilución 10 82 84 79 81,7 87 84 86 85,7 0,95 - 95% ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 56 51 48 51,7 57 51 54 54 0,96 - 96% ATCC 16404 54 Interpretación: La recuperación de microorganismos del primer ensayo independiente en la dilución 10-1 para los microorganismos Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis no cumplieron con el factor mayor de 2 (50% - 200%). Sin embargo, en la dilución 10-2 todos los microorganismos presentaron recuperación dentro del factor de 2 (50% - 200%). 55 Tabla 12. Recuperación de microorganismos en presencia del producto/ Ensayo 2 A B A/B Grupo de Prueba Grupo Control Control (UFC/mL) (UFC/mL) Negativo Muestra + Diluyente Neutralizante + Diluyente + Neutralizante + Nro. de Caldo Tripticasa % CEPAS ATCC Inóculo Inóculo ensayo: 2 Factor de Soya Recuperación Recuento de UFC/mL Promedio Recuento de UFC/mL Promedio Lecitina (0,5 %) (50% - 200%) de de Polisorbato 80 Placa Placa Placa UFC/mL Placa Placa Placa UFC /mL (4%) 1 2 3 1 2 3 Pseudomonas aeruginosa 83 80 85 82,7 89 86 90 88,3 0,94 - 93,6% ATCC 9027 Amonio Staphylococcus aureus 00 00 00 0,0 61 65 62 62,7 0,00 - 0,0% cuaternario ATCC 6538 Bacillus subtilis 00 00 00 0,0 61 59 64 61,3 0,00 - 0,0% Lote 1 ATCC 6633 Dilución 10-1 Candida albicans 88 85 82 85 87 83 88 86 0,99 - 98,8% ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 56 57 51 54,7 57 49 50 52 1,05 - 105,1% ATCC 16404 Pseudomonas aeruginosa 85 88 80 84,3 89 86 90 88,3 0,95 - 95,5% ATCC 9027 Staphylococcus aureus Amonio 65 59 63 62,3 61 65 62 62,7 0,99 - 99,5% ATCC 6538 cuaternario Bacillus subtilis 58 59 62 59,7 61 59 64 61,3 0,97 - 97,3% ATCC 6633 Lote 1 -2 Candida albicans Dilución 10 81 83 82 82 87 83 88 86 0,95 - 95,3% ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 52 49 57 52,7 57 49 50 52 1,01 - 101,3% ATCC 16404 Interpretación: La recuperación de microorganismos del segundo ensayo independiente en la dilución 10-1 para los microorganismos Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis no cumplieron con el factor mayor de 2 (50% - 200%). Sin embargo, en la dilución 10-2 todos los microorganismos presentaron recuperación dentro del factor de 2 (50% - 200%). 56 Tabla 13. Recuperación de microorganismos en presencia del producto/ Ensayo 3 A B A/B Control Grupo de Prueba Grupo Control Negativo (UFC/mL) (UFC/mL) Muestra + Diluyente Neutralizante + Diluyente + Neutralizante + % Nro. de CEPAS ATCC Inóculo Inóculo Caldo Tripticasa Recuperación ensayo: 3 Factor de Soya (50%-200%) Recuento de UFC/mL Promedio Recuento de UFC/mL Promedio Lecitina (0,5 %) de de Placa Placa Placa UFC/mL Placa Placa Placa Polisorbato 80 UFC /mL 1 2 3 1 2 3 (4%) Pseudomonas aeruginosa 90 87 81 86 82 83 80 81,7 1,05 - 105,3% ATCC 9027 Amonio Staphylococcus aureus 00 00 00 0,0 60 63 64 62,3 0,00 - 0,0% cuaternario ATCC 6538 Bacillus subtilis 00 00 00 0,0 57 65 59 60,3 0,00 - 0,0% Lote 1 ATCC 6633 Dilución 10-1 Candida albicans 88 82 79 83 79 83 79 80,3 1,03 - 103,3% Ensayo 1 ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 54 57 50 53,7 49 48 53 50 1,07 - 107,3% ATCC 16404 Pseudomonas aeruginosa 89 82 83 84,7 82 83 80 81,7 1,04 - 103,7% ATCC 9027 Staphylococcus aureus Amonio 62 61 64 62,3 60 63 64 62,3 1,00 - 100% ATCC 6538 cuaternario Bacillus subtilis 59 58 60 59 57 65 59 60,3 0,98 - 97,8% ATCC 6633 Lote 1 Candida albicans Dilución 10-2 81 88 82 83,7 79 83 79 80,3 1,04 - 104,1% ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis 49 50 57 52 49 48 53 50 1,04 - 104% ATCC 16404 57 Interpretación: La recuperación de microorganismos del tercer ensayo independiente en la dilución 10-1 para los microorganismos Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis no cumplieron con el factor mayor de 2 (50% - 200%). Sin embargo, en la dilución 10-2 todos los microorganismos presentaron recuperación dentro del factor de 2 (50% - 200%). 58 Tabla 14. Recuperación de microorganismos específicos Dilución 10-2 DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS A B Control Negativo Grupo de Prueba Grupo Control Nro. De CEPAS ATCC (UFC/mL) (UFC/mL) Caldo Tripticasa de Soya ensayo Muestra + Diluyente + Diluyente + Neutralizante Lecitina (0,5 %) Neutralizante + Inóculo + Inóculo Polisorbato 80 (4%) Pseudomonas aeruginosa + + - ATCC 9027 1 Staphylococcus aureus + + - ATCC 6538 Pseudomonas aeruginosa + + - ATCC 9027 2 Staphylococcus aureus + + - ATCC 6538 Pseudomonas aeruginosa + + - ATCC 9027 3 Staphylococcus aureus + + - ATCC 6538 (+) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Interpretación: Se observó presencia de crecimiento de los microorganismos específicos Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus en la dilución 10-2 en cada ensayo independiente. Tabla 15. Recuperación de microorganismos específicos en medios selectivos /Pseudomonas aeruginosa Dilución 10-2 SELECCIÓN Y SUBCULTIVO Control A B Negativo Grupo de Grupo Caldo Tripticasa Número Prueba Control de Soya FECHA de ensayo CEPAS ATCC Lecitina (0,05 %) Agar Cetrimide Polisorbato 80 (2%) Incubación: 30° C a 35° C por 18 - 72 h 1 Pseudomonas aeruginosa 19/01/2024 + + - ATCC 9027 2 Pseudomonas aeruginosa + + - ATCC 9027 3 Pseudomonas aeruginosa + + - ATCC 9027 (+) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Interpretación: Se observó recuperación del microorganismo Pseudomonas aeruginosa en agar Cetrimide en el grupo de Prueba (Dilución 10-2) y el grupo Control. 59 Tabla 16. Recuperación de microorganismos específicos en medios selectivos/ Staphylococcus aureus Dilución 10-2 SELECCIÓN Y SUBCULTIVO Control A B Negativo Grupo de Grupo Número Prueba Control Caldo Tripticasa de Soya FECHA de ensayo CEPAS ATCC Lecitina (0,05 %) Agar Manitol Salado Polisorbato 80 (2%) Incubación: 30° C a 35° C por 18 - 72 h 1 Staphylococcus aureus 19/01/2024 + + - ATCC 6538 2 Staphylococcus aureus + + - ATCC 6538 3 Staphylococcus aureus + + - ATCC 6538 Interpretación: Se observó recuperación del microorganismo Staphylococcus aureus en agar Manitol salado en el grupo de Prueba (Dilución 10-2) y el grupo Control. 60 De acuerdo con el Objetivo específico 4: VALIDACIÓN DEL METODO DE NEUTRALIZACIÓN Eficacia del Neutralizante Tabla 17. Comparación de la Eficacia neutralizante en el grupo de Prueba A (10-1) en referencia al grupo Control (B) Homogeneidad de varianzas Prueba Prueba de de Prueba Estadísticas de grupo Normalidad Levene T MICROORGANISMO Desviación Diferencia ( UFC) Grupo Media estándar p-valor p-valor de medias p-valor Conclusión de la prueba -1 Pseudomonas Prueba (A) 10 85,04 0,84 0,193 0,641 0,296 0,464 Grupo de Prueba = Grupo Control aeruginosa Control (B) 85,33 0,83 0,148 Prueba (A) 10-1Staphylococcus 0.00 0.00 _ 0,000 -59.000 0,000 Grupo de Prueba ≠ Grupo Control aureus Control (B) 59,00 3,08 0,158 Prueba (A) 10 -1 0,00 0,00 _ Bacillus subtilis 0,003 -61.000 0,000 Grupo de Prueba ≠ Grupo Control Control (B) 61,15 0,78 0,742 Prueba (A) 10-1 82,67 1,62 0,571 Candida albicans 0,762 -0.519 0,473 Grupo de Prueba = Grupo Control Control (B) 83,19 1,36 0,799 Aspergillus Prueba (A) 10 -1 51,67 0,91 0,175 1,00 -0.333 0,426 Grupo de Prueba = Grupo Control brasiliensis Control (B) 52,00 0,82 0,605 Interpretación: Para comparar los promedios, los dos grupos debían tener una distribución normal (para esto se realizó la Prueba de Shapiro Wilk) observándose un p-valor mayor 0,05 seguidamente se determinó la Homogeneidad de Varianzas mediante la prueba T, el cual mostro tener un p-valor mayor a 0,05 lo cual llevo para concluir que los promedios son iguales, de esa manera se demostró la eficacia adecuada del neutralizante. 61 Eficacia del Neutralizante Tabla 18. Comparación de la Eficacia neutralizante en el grupo de Prueba A (10-2) en referencia al grupo Control (B) Homogeneidad de varianzas Prueba Prueba de de Prueba Estadísticas de grupo Normalidad Levene T MICROORGANISMO Desviación Diferencia (UFC) Grupo Media estándar p-valor p-valor de medias p-valor Conclusión de la prueba -2 Pseudomonas Prueba (A) 10 85,82 1,43 0,855 0,110 0,481 0,395 Grupo de Prueba = Grupo Control aeruginosa Control (B) 85,33 0,83 0,148 Staphylococcus Prueba (A) 10 -2 58,00 1,20 0,158 0,002 -1,000 0,385 Grupo de Prueba = Grupo Control aureus Control (B) 59,00 3,08 0,321 Prueba (A) 10-2 60,48 0,56 0,256 Bacillus subtilis 0,371 -0,667 0,054 Grupo de Prueba = Grupo Control Control (B) 61,15 0,78 0,742 Prueba (A) 10-2 83,70 2,31 0,474 Candida albicans 0,366 0,519 0,570 Grupo de Prueba = Grupo Control Grupo Control (B) 83,19 1,36 0,799 Aspergillus Prueba (A) 10 -2 51,85 1,00 0,570 0,595 -0,148 0,735 Grupo de Prueba = Grupo Control brasiliensis Control (B) 52,00 0,82 0,605 Interpretación: Para comparar los promedios, los dos grupos debían tener una distribución normal (para esto se realizó la Prueba de Shapiro Wilk) observándose un p-valor mayor 0,05 seguidamente se determinó la Homogeneidad de Varianzas mediante la prueba T, el cual mostro tener un p-valor mayor a 0,05 lo cual llevo para concluir que los promedios son iguales, de esa manera se demostró la eficacia adecuada del neutralizante. 62 Toxicidad del Neutralizante Tabla 19. Comparación de la toxicidad del Neutralizante en el Grupo Control (B) en referencia al grupo Viabilidad (C) Homogeneidad de varianzas Prueba Prueba de de Estadísticas de grupo Normalidad Levene Prueba T MICROORGANISMO Desviación Diferencia (UFC) Grupo Media estándar p-valor p-valor de medias p-valor Conclusión de la prueba Control (B) 85,33 0,83 0,148 Pseudomonas 0,460 -0,074 0,826 Grupo de Control = Grupo Viabilidad aeruginosa Viabilidad (C) 85,41 0,55 0,259 Control (B) 59,00 3,08 0,321 Staphylococcus 0,003 -0,259 0,821 Grupo de Control = Grupo Viabilidad aureus Viabilidad (C) 59,26 1,32 0,152 Control (B) 61,15 0,78 0,742 Bacillus subtilis 0,283 -0,333 0,451 Grupo de Control = Grupo Viabilidad Viabilidad (C) 61,48 1,03 0,318 Control (B) 83,19 1,36 0,799 Candida albicans 0,553 -0,556 0,363 Grupo de Control = Grupo Viabilidad Viabilidad (C) 83,74 1,15 0,279 Control (B) 52,00 0,82 0,605 Aspergillus 0,543 0,111 0,827 Grupo de Control = Grupo Viabilidad brasiliensis Viabilidad (C) 51,89 1,26 0,188 Interpretación: Para comparar los promedios, los dos grupos debían tener una distribución normal (para esto se realizó la Prueba de Shapiro Wilk) observándose un p-valor mayor 0,05 seguidamente se determinó la Homogeneidad de Varianzas mediante la prueba T, el cual mostro tener un p-valor mayor a 0,05 lo cual llevo para concluir que los promedios son iguales, de esa manera se demostró la ausencia de toxicidad del neutralizante. 63 De acuerdo con el Objetivo específico 5: PARAMETROS DE VALIDACIÓN EXACTITUD Tabla 20. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo de prueba (A) Dilución 10-1/ Grupo Control (B) Hipótesis nula: Relación ≤ 0,5 o Relación ≥ 2 Hipótesis alterna: 0,5 < Relación < 2 N ivel de significancia: 0,05 Porcentaje de Grados MICROORGANISMO Desviación recuperación Intervalo de de Valor Conclusión de la (UFC) Grupo Media estándar (50 - 200 %) Relación Confianza de 90% libertad Valor T P prueba Pseudomonas Prueba (A) 10 -1 85,04 0,84 15 135,47 0,000 Se puede afirmar 99,7 0,997 (0,988; 1,005) aeruginosa equivalencia Control (B) 85,33 0,83 15 -135,62 0,000 Prueba (A) 10-1 0,00 0,00 _ _ _ No se puede Staphylococcus 0,0 _ _ afirmar aureus Control (B) 59,00 3,08 _ _ _ equivalencia Prueba (A) 10-1 0,00 0,00 _ _ _ No se puede Bacillus subtilis 0,0 _ _ afirmar Control (B) 61,15 0,78 _ _ _ equivalencia Prueba (A) 10 -1 82,67 1,62 15 70,008 0,000 Se puede afirmar Candida albicans 99,4 0,994 (0,979; 1,009) equivalencia Control (B) 83,19 1,36 15 -79,470 0,000 -1 Aspergillus Prueba (A) 10 51,67 0,91 15 77,000 0,000 Se puede afirmar 99,4 0,994 (0,980; 1,007) brasiliensis equivalencia Control (B) 52,00 0,82 15 -83,920 0,000 Interpretación: La prueba de hipótesis de dos colas, evaluó el porcentaje de recuperación entre grupos, la relación de las medias debía encontrarse entre 0,5 a 2; lo cual llevó a concluir y afirmar equivalencia con un intervalo de confianza del 90%. 64 Tabla 21. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo de prueba (A) Dilución 10-2/ Grupo Control (B) Hipótesis nula: Relación ≤ 0,5 o Relación ≥ 2 Hipótesis alterna: 0,5 < Relación < 2 Nivel de significancia: 0,05 Porcentaje de Grados MICROORGANISMO Desviación recuperación Intervalo de de Valor Conclusión de la (UFC) Grupo Media estándar (50 - 200 %) Relación Confianza de 90% libertad Valor T P prueba Pseudomonas Prueba (A) 10 -2 85,81 1,43 14 105,89 0,000 Se puede afirmar 100,6 1,000 (0,991; 1,010) aeruginosa Control (B) 85,33 0,83 14 -126.87 0,000 equivalencia Staphylococcus Prueba (A) 10 -2 58,00 1,20 10 43,749 0,000 Se puede afirmar 98,3 0,983 (0,951; 1,017) aureus Control (B) 59,00 3,08 10 -28,660 0,000 equivalencia Prueba (A) 10-2 60,48 0,56 14 131,97 0,000 Se puede afirmar Bacillus subtilis 98,9 0,989 (0,980; 0,998) Control (B) 61,15 0,78 14 -111,51 0,000 equivalencia Prueba (A) 10-2 83,70 2,31 12 52,435 0,000 Se puede afirmar Candida albicans 100,6 1,006 (0,987; 1,026) Control (B) 83,19 1,36 12 -69,614 0,000 equivalencia Prueba (A) 10-2 51,85 1,00 15 71,708 0,000 Aspergillus Se puede afirmar Grupo Control 99,7 0,997 (0,983; 1,012) brasiliensis 52,00 0,82 15 -81,666 0,000 equivalencia (B) Interpretación: La prueba de hipótesis de dos colas, evaluó el porcentaje de recuperación entre grupos, la relación de las medias debía encontrarse entre 0,5 a 2; lo cual llevó a concluir y afirmar equivalencia con un intervalo de confianza del 90%. 65 Tabla 22. Prueba de equivalencia de dos muestras: Grupo Control (B) / Grupo Viabilidad (C) Hipótesis nula: Relación ≤ 0,5 o Relación ≥ 2 Hipótesis alterna: 0,5 < Relación < 2 Nivel de significancia: 0,05 Porcentaje de MICROORGANISMO Desviación recuperación Intervalo de Grados de Valor Conclusión de (UFC) Grupo Media estándar (50 - 200 %) Relación Confianza de 90% libertad Valor T P la prueba Pseudomonas Control (B) 85,33 0,83 13 145,81 0,000 Se puede 99,9 0,999 (0,992;1,006) afirmar aeruginosa Viabilidad (C) 85,41 0,55 13 -186,44 0,000 equivalencia Staphylococcu Control (B) 59,00 3,08 10 27,953 0,000 Se puede 99,6 0,996 (0,967;1,030) afirmar s aureus Viabilidad (C) 59,26 1,32 10 -43,990 0,000 equivalencia Bacillus Control (B) 61,15 0,78 14 97,306 0,000 Se puede 99,5 0,995 (0,982; 1,007) afirmar subtilis Viabilidad (C) 61,48 1,03 14 -84,217 0,000 equivalencia Se puede Candida Control (B) 83,19 1,36 15 84,174 0,000 99,3 0,993 (0,981;1,006) afirmar albicans Viabilidad (C) 83,74 1,15 15 -94,608 0,000 equivalencia Aspergillus Control (B) 52,00 0,8 2 13 75,833 0,000 Se puede 100,2 1;002 (0,985; 1,019) afirmar brasiliensis Viabilidad (C) 51,89 1,2 6 13 -58,710 0,000 equivalencia Interpretación: La prueba de hipótesis de dos colas, evaluó el porcentaje de recuperación entre grupos, la relación de las medias debía encontrarse entre 0,5 a 2; lo cual llevó a concluir y afirmar equivalencia con un intervalo de confianza del 90%. 66 PRECISIÓN Tabla 23. Resultados de Coeficiente de Variación en los grupos de tratamiento. Coeficiente de MICROORGANISMO Número de Desviación variación (UFC) Grupo casos Media estándar (< 15%) Prueba (A) 10-1 9 85,04 0,84 0,99 Pseudomonas Prueba (A) 10 -2 9 85,81 1,43 1,66 aeruginosa Control (B) 9 85,33 0,83 0,98 Viabilidad (C) 9 85,41 0,55 0,64 Prueba (A) 10-1 9 0,00 0,00 N/A Staphylococcus Prueba (A) 10 -2 9 58,00 1,20 2,07 aureus Control (B) 9 59,00 3,08 5,22 Viabilidad (C) 9 59,26 1,32 2,23 Prueba (A) 10-1 9 0,00 0,00 N/A Prueba (A) 10-2 9 60,48 0,56 0,92 Bacillus subtilis Control (B) 9 61,15 0,78 1,28 Viabilidad (C) 9 61,48 1,03 1,67 Prueba (A) 10-1 9 82,67 1,62 1,97 Prueba (A) 10-2 9 83,70 2,31 2,76 Candida albicans Control (B) 9 83,19 1,36 1,63 Viabilidad (C) 9 83,74 1,15 1,38 Prueba (A) 10-1 9 51,67 0,91 1,77 Aspergillus Prueba (A) 10 -2 9 51,85 1,00 1,93 brasiliensis Control (B) 9 52,00 0,82 1,57 Viabilidad (C) 9 51,89 1,26 2,43 N/A no aplica los recuentos son contantes =0 Interpretación: La mayor variación entre los recuentos se encontró en el Grupo Control para Staphylococcus aureus (5,22 %), cumpliendo la especificación del coeficiente de variación < 15%. 67 ESPECIFICIDAD Tabla 24. Comparación entre grupo de Prueba (A) Dilución 10-2/ Grupo Control (B) MICROORGANISMO (UFC) Grupo p-valor Conclusión Prueba (A) 10-2 Pseudomonas 0,395 Grupo de Prueba = Grupo Control aeruginosa Control (B) Prueba (A) 10-2 Staphylococcus 0,385 Grupo de Prueba = Grupo Control aureus Control (B) Prueba (A) 10-2 Bacillus subtilis 0,054 Grupo de Prueba = Grupo Control Control (B) Prueba (A) 10-2 Candida albicans 0,570 Grupo de Prueba = Grupo Control Control (B) Prueba (A) 10-2 Aspergillus 0,735 Grupo de Prueba = Grupo Control brasiliensis Control (B) Interpretación: Para comparar los promedios, los dos grupos debían tener una distribución normal (para esto se realizó la Prueba de Shapiro Wilk) observándose un p-valor mayor 0,05 seguidamente se determinó la Homogeneidad de Varianzas mediante la prueba T, el cual mostro tener un p-valor mayor a 0,05 lo cual llevo para concluir que los promedios son iguales, de esa manera se demostró que el método de dilución neutralización fue el adecuado. 68 LÍMITE DE DETECCION Tabla 25. Límite de Detección de Pseudomonas aeruginosa Producto: Amonio Cuaternario al 0,25% Lote: 01 Dilución: 10-2 Número de ensayo: 1 Microorganismo: Pseudomonas aeruginosa Recuento de Inóculo Estandarizado: LÍMITE DE DETECCIÓN A B Grupo de Prueba Grupo Control (UFC/mL) (UFC/mL) Muestra + Diluyente + Neutralizante Diluyente + Neutralizante + Inóculo + Inóculo Número de UFC/mL Número de UFC/mL Inóculo Dil 1 Dil 2 Dil 3 Inóculo Dil 1 Dil 2 Dil 3 N° de Repeticiones 84 42 21 11 84 42 21 11 1era Repetición + + + + + + + + 2da Repetición + + + + + + + + 3era Repetición + + + + + + + + 4ta Repetición + + + + + + + + 5ta Repetición + + + + + + + + Resultado de Límite de >11 UFC >11 UFC Detección ( > 90%) (+ ) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Interpretación: Se evaluó la turbidez en las 5 réplicas simultaneas de cada dilución que permitió el crecimiento, lo cual estableció el límite mínimo de recuperación de microrganismos en los Grupos de ensayo no menor del 90 % 69 Tabla 26. Límite de Detección de Staphylococcus aureus Producto: Amonio Cuaternario al 0,25% Lote: 01 Dilución: 10-2 Número de ensayo: 1 Microorganismo: Staphylococcus aureus Recuento de Inóculo Estandarizado: LÍMITE DE DETECCIÓN A B Grupo de Prueba Grupo Control (UFC/mL) (UFC/mL) Muestra + Diluyente + Neutralizante Diluyente + Neutralizante + Inóculo + Inóculo Número de UFC/mL Número de UFC/mL Inóculo Dil 1 Dil 2 Dil 3 Inóculo Dil 1 Dil 2 Dil 3 N° de Repeticiones 67 34 17 8 67 34 17 8 1era Repetición + + + + + + + + 2da Repetición + + + - + + + + 3era Repetición + + + + + + + + 4ta Repetición + + + + + + + + 5ta Repetición + + + - + + + + Resultado de Límite de >17 UFC 8 UFC Detección ( > 90%) (+ ) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Interpretación: Se evaluó la turbidez en las 5 réplicas simultaneas de cada dilución que permitió el crecimiento, lo cual estableció el límite mínimo de recuperación de microrganismos en los Grupos de ensayo no menor del 90 %. 70 ROBUSTEZ Tabla 27. Estadística de muestras emparejadas en grupos de tratamiento Estadísticas de muestras emparejadas Número Desviación Diferencias Sig. Microorganismo Grupo UFC Media de casos estándar de medias (bilateral) Conclusión FECHA 1 85,04 9 0,84 Promedios significativamente Prueba (A) 10-1 Par 1 -0.111 0,081 FECHA 2 85,15 9 0,84 iguales FECHA 1 85,81 9 1,43 Promedios significativamente Prueba (A) 10-2 Par 1 -0.037 0,347 Pseudomonas FECHA 2 85,85 9 1,43 iguales aeruginosa FECHA 1 85,33 9 0,83 Promedios significativamente Control (B) Par 1 -0.074 0,169 FECHA 2 85,41 9 0,91 iguales FECHA 1 85,41 9 0,55 Promedios significativamente Viabilidad (C) Par 1 -0.074 0,169 FECHA 2 85,48 9 0,58 iguales FECHA 1 0,00 9 0,00 Prueba (A) 10-1 Par 1 N/A - N/A FECHA 2 0,00 9 0,00 FECHA 1 58,00 9 1,20 Promedios significativamente Prueba (A) 10-2 Par 1 -0.074 0,169 Staphylococcus FECHA 2 58,07 9 1,18 iguales aureus FECHA 1 59,00 9 3,08 Promedios significativamente Control (B) Par 1 -0.111 0,081 FECHA 2 59,11 9 3,19 iguales FECHA 1 59,26 9 1,32 Promedios significativamente Viabilidad (C) Par 1 -0.111 0,081 FECHA 2 59,37 9 1,35 iguales FECHA 1 0.00 9 0,00 -1 Promedios significativamente Prueba (A) 10 Par 1 -0.111 0,081 FECHA 2 0.11 9 0,17 iguales FECHA 1 60,48 9 0,56 Promedios significativamente Prueba (A) 10-2 Par 1 -0.037 0,347 Bacillus subtilis FECHA 2 60,52 9 0,58 iguales FECHA 1 61,15 9 0,78 Promedios significativamente Control (B) Par 1 -0.111 0,081 FECHA 2 61,26 9 0,83 iguales Viabilidad (C) Par 1 FECHA 1 61,48 9 1,03 N/A - N/A 71 FECHA 2 61,48 9 1,03 FECHA 1 82,67 9 1,62 Promedios significativamente Prueba (A) 10-1 Par 1 -0.111 0,195 FECHA 2 82,78 9 1,54 iguales FECHA 1 83,70 9 2,31 Prueba (A) 10-2 Par 1 N/A - N/A Candida FECHA 2 83,70 9 2,31 albicans FECHA 1 83,19 9 1,36 Promedios significativamente Control (B) Par 1 -0.074 0,169 FECHA 2 83,26 9 1,30 iguales FECHA 1 83,74 9 1,15 Promedios significativamente Viabilidad (C) Par 1 -0.037 0,347 FECHA 2 83,78 9 1,11 iguales FECHA 1 51,67 9 0,91 -1 Promedios significativamente Prueba (A) 10 Par 1 -0.074 0,169 FECHA 2 51,74 9 0,89 iguales FECHA 1 51,85 9 1,00 Promedios significativamente Prueba (A) 10-2 Par 1 -0.111 0,195 Aspergillus FECHA 2 51,96 9 0,99 iguales brasiliensis FECHA 1 52,00 9 0,82 Promedios significativamente Control (B) Par 1 -0.111 0,195 FECHA 2 52,11 9 0,87 iguales FECHA 1 51,89 9 1,26 Promedios significativamente Viabilidad (C) Par 1 -0.111 0,195 FECHA 2 52,00 9 1,26 iguales N /A: No aplica. Los recuentos son constantes = 0 Interpretación: Se observó que el promedio de los recuentos de los microorganismos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis en un tiempo de incubación de 3 días (Fecha 1) en comparación a 5 días (Fecha 2) y los microorganismos Candida albicans y Aspergillus brasiliensis en un tiempo de incubación de 5 días (Fecha 1) en comparación a 7 días (Fecha 2) de incubación, no presentaron diferencias significativas en los recuentos, ya que se observó que el p- valor es mayor a 0,05 con un intervalo de 95% de confianza, el cual llevó a concluir que los promedios son significativamente iguales. 72 4.1.2 Prueba de hipótesis Se demostró el cumplimiento de la estandarización de cepas, Promoción de crecimiento, Aptitud del Método, Validación del método de neutralización y los Parámetros de validación: Exactitud, Precisión, Especificidad, Límite de detección y Robustez, se encontraron dentro de las especificaciones establecidas, por el cual se da validez al método, rechazando la hipótesis nula y aceptando la hipótesis alterna. 4.1.3 Discusión de resultados La estandarización de cepas microbianas obtuvo resultados reproducibles menores a 100 UFC en todos los microorganismos de prueba, estos resultados son comparados con las especificaciones de la Farmacopea Americana NF 2023, el cual es usado de referencia para productos Farmacéuticos, donde indica que para la estandarización del inoculo no debe ser mayor de 100 UFC. La Promoción de crecimiento permitió la recuperación de los microorganismos que no deben diferir un factor mayor de 2, el cual demuestra que los medios de cultivo se encontraban aptos para su uso en los ensayos de Aptitud y Validación microbiológica del dispositivo médico evaluado. El cual es comparable con la Farmacopea Americana NF 2023 para la evaluación de medios de cultivo utilizado en el análisis de productos Farmacéuticos, el cual especifica que la recuperación de microorganismos no debe diferir en factor mayor de 2 con respecto a un inoculo estandarizado. 73 La Aptitud del Método de recuento mediante la dilución y neutralización con Lecitina de Soya 0,5% y Polisorbato 80 4% en la dilución 10-1 no neutralizo completamente al Amonio Cuaternario, el cual no se observó la recuperación de los microorganismos de prueba: Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, pero en la dilución 10-2 se logra neutralizar completamente al Amonio Cuaternario, permitiendo la recuperación de todos los microorganismos de prueba, en un porcentaje de recuperación que no difiere en un factor mayor de 2, en el estudio de Araujo et al (11) utilizó como método de neutralización, el uso de Lecitina de Soja 0,5% y 0,4 % de Polisorbato 80, obteniendo una recuperación de microrganismos dentro del factor 2. Asu vez Arias et al. (12) utilizando como neutralizante al polisorbato, presentando recuperación de microorganismos mayores al 70%. La validación del método de neutralización presenta igualdad de promedios en todos los microorganismos y entre los grupos de Prueba (A) de la dilución 10-2 en referencia al grupo control (B), observándose un p- valor mayor al 0,05 por el cual se demostró eficacia adecuada del neutralizante, a su vez también se demostró la ausencia de toxicidad del neutralizante al presentar igualdad en los recuentros del grupo Control (B) en referencia al grupo Viabilidad (C) , en la investigación de García y paredes (13) presentaron eficacia del neutralizante al obtener recuperación similar entre los grupos (A) y (B) y ausencia de toxicidad al comparar el grupo de (B) y (C). En cuanto a la determinación de los Parámetros de la Validación: La exactitud de los porcentajes de recuperación demostró que los resultados de la relación de los promedios se 74 encontraron dentro del intervalo de confianza (0,5 a 2), el cual cumplieron cuando hay recuperación de microorganismos; a su vez para la Precisión entre los recuentos se observó que el máximo coeficiente de variación encontrado fue de 5,22 %. El parámetro del Límite de detección en la dilución 10-2 para el microorganismo Pseudomonas aeruginosa recupero 11 UFC y para Staphylococcus aureus 17 UFC; el parámetro de Especificidad, estadísticamente demostró la recuperación de los microorganismos en una dilución 10-2 en presencia del producto y neutralizante, finalmente se demostró la robustez del método al no haber diferencias significativas de los recuentos en las diferentes tiempos de incubación; en comparación con los hallazgos de Morales (16) obtuvieron resultados de Exactitud dentro del factor de 2 en comparación al control; en la Precisión demostró que en el grupo de prueba y grupo control, no presenta variabilidad significativa en los recuentos de acuerdo al valor de la prueba “t” de Student, para el Parámetro robustez en referencia a los tiempos de incubación existe similitud en los recuentos para ambos grupos, a su vez Sueros (15) en el año 2013 en su investigación obtuvo resultados de límite de detección 5 ufc/mL como la mínima cantidad detectada. Los resultados de Precisión de cada analista como entre ellos obtuvieron una desviación estándar relativa menor a 0,02. El parámetro de Robustez usando distintos medios de cultivo y tiempo de incubación se obtiene un coeficiente de variación de máximo 15%. 75 CAPITULO V: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1 Conclusiones En esta investigación se concluyó: Primera: En cuanto a los inóculos estandarizados cumplen con la especificación de la Farmacopea Americana en cuanto al número de unidades formadoras de colonias. Segunda: La Promoción de Crecimiento de medios de cultivos demostró que estuvieron aptos para los análisis de Aptitud del Método de Recuento y Validación del ensayo microbiológico. Tercera: La Prueba de Aptitud del Método de Recuento demostró la recuperación satisfactoria de los microorganismos en una dilución especifica, a su vez permitió detectar e identificar los microorganismos específicos. Cuarta: La Validación del Método de Neutralización con el uso de neutralizantes, resulto ser eficaz y no tóxico para los Microorganismos de prueba. 76 Quinta: Los Parámetros de validación: Exactitud, Precisión, Especificidad, Límite de detección y Robustez cumplieron de acuerdo con las especificaciones establecidas. 5.2 Recomendaciones • Se recomienda que el analista que realice la validación sea la más calificada para realizar este ensayo. • Este método puede adecuarse para otras investigaciones de Validación Microbiológica a dispositivos Médicos derivados de Amonio Cuaternario. • De tener distintas concentraciones de Productos de Amonio Cuaternario, trabajar con el que presenta la concentración más alta de Amonio Cuaternario, para no modificar el neutralizante. 77 REFERENCIAS 1. Chacón L, Rojas J. Resistencia a desinfectantes y su relación con la resistencia a los antibióticos. Scielo.sa.cr. [Internet]. 2020; 62(1):7-12. [Consultado el 10 de agosto de 2023]. 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LIMA 2023” Problema Objetivos Hipótesis Variables Diseño Metodológico Problema general Objetivo general Hipótesis General ¿Será posible validar el ensayo Determinar la validez del ensayo Ho: No existe validez del ensayo microbiológico de una solución de microbiológico de una solución de microbiológico de una solución de Amonio Método: Hipotético - Deductivo Amonio Cuaternario al 0,25 % Amonio Cuaternario al 0,25% para Cuaternario al 0,25% para limpieza de para limpieza de superficies, limpieza de superficies, basado en superficies, basado en la Farmacopea Enfoque: Cuantitativo basado en la Farmacopea la Farmacopea Americana vigente. Americana Vigente. Americana vigente. ¿Lima 2023? Lima 2023 Ha: Existe validez del ensayo microbiológico Tipo: Aplicativo de una solución de Amonio Cuaternario al 0,25% para limpieza de superficies, basado en Diseño: Experimental la Farmacopea Americana Vigente. Corte: Transversal Problemas específicos Objetivos específicos Hipótesis Especificas Nivel o alcance: Explicativo ¿Cómo se estandariza las cepas de Estandarizar las cepas de referencia basado en la referencia basado en la No aplica Farmacopea Americana? Farmacopea Americana Validación ¿Cómo se verifica la prueba de Realizar la prueba de Promoción Promoción de crecimiento de los de Crecimiento de los medios de medios de cultivo basado en la cultivo basados en la Farmacopea No aplica Farmacopea Americana? Americana. ¿Cómo se realiza el procedimiento Determinar la Aptitud del método de Aptitud del Método en en presencia del producto basado No aplica presencia del producto basado la la Farmacopea Americana Farmacopea Americana? ¿Cuál será la Validación del Determinar la Validación del método de neutralización más método de Neutralización más adecuado para neutralizar las adecuado para neutralizar las No aplica propiedades antimicrobianas propiedades antimicrobianas basado en la Farmacopea basado en la Farmacopea Americana? Americana. ¿Cuáles son los Parámetros de Determinar los Parámetros de Validación del ensayo Validación del ensayo No aplica microbiológico basado en la Microbiológico basado en la Farmacopea Americana? Farmacopea Americana 87 Anexo 2: Instrumento de recolección de datos FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS DE ESTANDARIZACIÓN DE CEPAS DE PRUEBA FECHA DE ESTANDARIZACIÓN: ………………………. DILUYENTE: ……………………………………………… EQUIPO UTILIZADO: …………………………………….. RECUENTO EN PLACA Pseudomonas Staphylococcus Escherichia Bacillus Candida Aspergillus CEPA DE aeruginosa aureus coli subtilis albicans brasiliensis PRUEBA ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC 8739 ATCC 6633 ATCC 10231 ATCC 16404 ABSORBANCIA DILUCIONES 10-6 10-6 10-6 10-5 10-4 10-4 TEMPERATURA 30° C - 35° C 20° C - 25° C / TIEMPO DE 72 horas 5 días INCUBACIÓN 1era PLACA 2da PLACA 3era PLACA 4ta PLACA 5ta PLACA PROMEDIO UFC/mL Observaciones: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 88 FORMATO DE REGISTRO DE PRUEBA DE PROMOCIÓN E INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO FECHA DE ANÁLISIS: …………………… FECHA DE PREPARACIÓN: …………………… FECHA DE LECTURA: …………………… MARCA DE MEDIO DE CULTIVO: …………… MEDIO DE CULTIVO: …………………… I. PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO ( ) CEPAS DE PRUEBA Pseudomonas Staphylococcus Bacillus Candida Aspergillus aeruginosa aureus subtilis albicans brasiliensis ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC6633 ATCC 10231 ATCC 16404 RECUENTO DE INÓCULO ESTANDARIZADO PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO RECUENTO UFC/mL CONTROL NEGATIVO RESULTADO (%) 50 - 200% Medios líquidos: (+) Presencia de Crecimiento ( - ) Ausencia de Crecimiento ( / ) No aplica II. PROPIEDADES INDICADORAS DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS ( ) CEPAS DE PRUEBA Pseudomonas Staphylococcus Escherichia Candida aeruginosa aureus coli albicans ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC 8739 ATCC 10231 RECUENTO DE INÓCULO ESTANDARIZADO PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO RECUENTO UFC/mL PRUEBA INHIBITORIA CONTROL NEGATIVO RESULTADO (%) 50 - 200 % Medios líquidos: (+) Presencia de Crecimiento ( - ) Ausencia de Crecimiento ( / ) No aplica Observaciones: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 89 FORMATO DE REGISTRO DE LA PRUEBA DE LA APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO Y MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS Producto /N° Lote Fecha: Dilución: Número de ensayo: APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO Y MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO A B A/B Grupo de Prueba Grupo Control Control (UFC/mL) (UFC/mL) Negativo Muestra + Diluyente + Diluyente +Neutralizante + Caldo CEPAS Neutralizante + Inóculo Inóculo Tripticasa % ATCC Factor Recuento de UFC/mL Recuento de UFC/mL de Soya Recuperación Promedi Promedio Lecitina Placa Placa Placa o de Placa Placa Placa de (0,5 %) 1 2 3 UFC/mL 1 2 3 UFC /mL Polisorbato 80 (4%) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacillus subtilis ATCC 6633 Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 Dilución 10-2 DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS A B Control Negativo Grupo de Prueba Grupo Control (UFC/mL) (UFC/mL) Caldo Tripticasa de Soya CEPAS ATCC Muestra + Diluyente Diluyente + Neutralizante Lecitina (0,5 %) Neutralizante + Inóculo + Inóculo Polisorbato 80 (4%) Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 (+) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Observaciones: _____________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ 90 FORMATO DE VALIDACIÓN DE MÉTODO DE NEUTRALIZACIÓN EN GRUPOS DE TRATAMIENTO Producto: Fecha: Dilución: Tiempo de incubación: COMPARACION DE GRUPOS DE TRATAMIENTO Microorganismo: A B C Control Grupo Grupo Grupo de Prueba Control Viabilidad Negativo (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) Número de Repeticiones Caldo Muestra + Diluyente + Diluyente + Neutralizante Diluyente + Tripticasa de Neutralizante + Inóculo + Inóculo Inóculo Soya Lecitina (0,5 Recuento de Recuento de UFC/mL Recuento de Promedio Promedio Promedio %) UFC/mL UFC/mL de de de Polisorbato Placa Placa Placa Placa Placa Placa Placa Placa Placa UFC/mL UFC/mL UFC/ mL 80 (4%) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1er Ensayo N° de lote: 2do Ensayo N° de lote: 3er Ensayo N° de lote: 4to Ensayo N° de lote: 5to Ensayo N° de lote: 6to Ensayo N° de lote: 7mo Ensayo N° de lote: 8vo Ensayo N° de lote: 9no Ensayo N° de lote: PROMEDIO (-) Ausencia de crecimiento Observaciones: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 91 FORMATO DE REGISTRO DEL LÍMITE DE DETECCIÓN Producto /N° Lote: Fecha: Dilución: Número de ensayo: LÍMITE DE DETECCIÓN Microorganismo: Recuento de Inóculo Estandarizado: A B Grupo de Prueba Grupo Control (UFC/mL) (UFC/mL) Muestra + Peptona + Diluyente + Neutralizante + Inóculo Diluyente + Neutralizante + Inóculo Número de UFC/mL Número de UFC/mL Inóculo Dil 1 Dil2 Dil 3 Inóculo Dil 1 Dil 2 Dil 3 N° de Repeticiones 1era Repetición 2da Repetición 3era Repetición 4ta Repetición 5ta Repetición Resultado de Límite de Detección (> 90%) (+) Presencia de crecimiento (-) Ausencia de crecimiento Observaciones: ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 92 Anexo 3: Certificado de Validez del contenido del instrumento 93 94 95 96 97 98 99 100 101 Anexo 4: Confiablidad del instrumento No aplica Anexo 5: Aprobación del Comité de ética 102 Anexo 6: Carta de aprobación de la institución para la recolección de datos 103 Anexo 7: Testimonios fotográficos Imagen1.Preparación de medios de cultivo Imagen 2. Esterilización en autoclave Imagen 3. Dilución y preparación de un ensayo independiente de los Grupos A, B y C. Imagen 4. Estandarización de cepas ATCC 104 Imagen 5. Recuento de unidad formadoras de colonias (UFC) Imagen 6. Recuperación de Microorganismos: Staphylococcus aureus a partir de la dilución 10-2 en el Grupo de Prueba (A) Imagen 7. Recuperación de Microorganismos específicos en la dilución 10-2 de las cepas: ➢ Izquierda: Crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en Agar Cetrimide ➢ Derecha: Crecimiento de Staphylococcus aureus en Agar Manitol Salado 105 Anexo 8: Informe del asesor de Turnitin 106 Anexo 9: Materiales y equipos de Ensayo MATERIALES Y CRISTALERIA ⮚ Micropipetas automáticas de rango de medición de 5 a 200 ul y de 100 a 1000 ul ⮚ Pipetas de 1 mL, 5mL y 10 mL descartable estériles ⮚ Placas de Petri descartable estériles ⮚ Tips estériles ⮚ Asa de siembra descartable estéril ⮚ Espátula de Drigaslky ⮚ Cubetas de Cuarzo ⮚ Probeta graduada de 100 mL ⮚ Frasco de vidrio de tapa rosca de 100, 200 y500 mL ⮚ Tubos de ensayo con tapa rosca estériles MEDIOS DE CULTIVO ⮚ Caldo Tripticasa de Soya ⮚ Caldo Sabouraud ⮚ Buffer Peptona ⮚ Agar Tripticasa de soya ⮚ Agar Sabouraud Dextrosa ⮚ Agar Cetrimide ⮚ Agar Manitol Salado 107 REACTIVOS ⮚ Lecitina de soya ⮚ Polisorbato 80 (Tween 80) ⮚ Glicerol EQUIPOS ⮚ Cabina de Flujo laminar y cabina de Bioseguridad ⮚ Vortex ⮚ Espectrofotómetro UV Visible ⮚ Baño María ⮚ Balanza de Precisión ⮚ Autoclave de esterilización ⮚ Incubadora de 20° C - 25° C y 30° C - 35° C CEPAS ATCC ⮚ Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ⮚ Staphylococcus aureus ATCC 6538 ⮚ Escherichia coli ATCC 8739 ⮚ Bacillus subtilis ATCC 6633 ⮚ Candida albicans ATCC 10231 ⮚ Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 108 Anexo 10: Flujograma del Proceso de Validación VALIDACIÓN MICROBI OLÓGICA Estandarización de Cepas ¿Cumple NO Preparar y realizar nueva recuento suspensión de microorganismos < 100 ufc? SI Promoción de Medios de Cultivo P r e p a r a r n u e v o s m e d i o s d e c u l t i v o NO ¿ C u m p l e factor 2? SI Aptitud del Método o Idoneidad NO SI ¿ C u m p l e factor 2? Desarrollar otro método de N e u tr a l i z a c i ó n SI Validación de recuento Cumple microbiano NO Parámetros de Validación del Producto no puede Validación método de neutralizarse, por la neutralización actividad microbicida que presenta. Exactitud Eficacia del Neutralizante Precisión Toxicidad del Especificidad Neutralizante Límite de detección Robustez Fuente: Elaboración Propia Reporte de similitud 12% de similitud general Principales fuentes encontradas en las siguientes bases de datos: 11% Base de datos de Internet 1% Base de datos de publicaciones Base de datos de Crossref Base de datos de contenido publicado de Crossref 6% Base de datos de trabajos entregados FUENTES PRINCIPALES Las fuentes con el mayor número de coincidencias dentro de la entrega. Las fuentes superpuestas no se mostrarán. qdoc.tips 1 2% Internet repositorio.uwiener.edu.pe 2 2% Internet argentina.gob.ar 3 <1% Internet aam.org.ar 4 <1% Internet hdl.handle.net 5 <1% Internet cybertesis.unmsm.edu.pe 6 <1% Internet repositorio.unamba.edu.pe 7 <1% Internet coursehero.com 8 <1% Internet Descripción general de fuentes